揭秘胎儿基因 Pontin：心脏病理性重塑及心肌病防治的关键新靶点

为探究胎儿基因 Pontin 在成年心脏中的作用，英国曼彻斯特大学的研究人员开展相关研究。结果发现 Pontin 可调节心肌细胞功能，或通过 Hippo 通路保护心脏。这一成果为防治心脏疾病提供新方向，极具科研价值，推荐大家阅读。

　　

胎儿基因 Pontin 的表达对保护心脏免受病理性重塑和心肌病的侵害至关重要

摘要：心脏重塑是心力衰竭发展过程中的关键环节。胎儿心脏基因的重新激活通常与心脏重塑相关。英国曼彻斯特大学生物学、医学与健康学院心血管科学系（第一作者单位）的研究人员在此研究了在胚胎心脏中高表达的 Pontin（Ruvbl1）在介导成年小鼠心脏不良重塑中的作用。研究人员观察到，心肌细胞中 Pontin 的缺失会导致细胞凋亡增加、肥大和纤维化加剧，而 Pontin 的过表达则能提高存活率、促进细胞增殖并减轻肥大反应。此外，RNA 测序分析表明，在 Pontin 基因敲除的情况下，参与细胞周期调控、细胞增殖以及细胞存活 / 凋亡的基因表达存在差异。具体而言，研究人员在 Pontin 基因敲除小鼠中检测到 Hippo 通路成分的表达变化。利用细胞模型，研究人员发现 Pontin 可诱导 YAP 活性、YAP 核转位以及转录活性。这些研究结果表明，Pontin 是心脏不良重塑的调节因子，可能通过调节 Hippo 通路发挥作用。这项研究可能为通过靶向 Pontin 来控制心脏重塑开辟新的途径。

研究背景

心脏重塑是心脏对病理性刺激产生的一种关键反应过程。病理性重塑的特征包括心脏大小和形状的改变（肥大和扩张）、由于细胞凋亡和坏死导致的心肌细胞丢失，以及肌成纤维细胞的激活引发的纤维化。若不加以治疗，心脏重塑可能会进展为心脏功能严重下降，最终导致心力衰竭。

胎儿心脏基因的重新激活常常与肥大性重塑相关。这些胎儿心脏基因在胚胎心脏发育期间通常处于表达状态，而在出生后或成年心脏中其表达会逐渐减弱。在病理状态下，成年心脏中这些基因的重新激活和再次表达，可能是参与心脏重塑过程的信号通路（如心肌细胞增强因子 2（MEF2）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、Wnt/β - 连环蛋白以及钙调神经磷酸酶 - NFAT 通路）激活的结果。这些通路的激活最终会导致转录因子的活化，进而诱导包括胎儿心脏基因程序在内的基因表达。

重要的是，一些胎儿心脏基因可能在胚胎发育过程中通过调节心肌细胞增殖，对心脏生长发挥至关重要的作用。对胎儿和成年心脏基因表达谱的分析显示，与细胞周期控制和 DNA 复制相关的基因群，是差异调节最为显著的基因之一，在胎儿心脏中的表达水平要高得多。在病理情况下调节这类基因，可能有助于诱导心脏再生、控制心脏重塑并预防心力衰竭的进展。同样，过表达其他已知的胎儿心脏基因（如脑钠肽（BNP）），在应激刺激后可能改善心脏功能，而缺乏心房钠尿肽（ANP）的心脏则会发展出更严重的心肌病。因此，研究胎儿心脏基因在成年心脏中的作用至关重要。

在斑马鱼中进行的遗传筛选分析，鉴定出了一种由 Pontin（Ruvbl1）和 Reptin（Ruvbl2）组成的蛋白质复合物。这些蛋白质属于 AAA +（与多种细胞活动相关的 ATP 酶）蛋白家族，具有多种功能，包括调节细胞周期、有丝分裂、转录因子调控以及 DNA 损伤应答等。在斑马鱼中，这两种分子在介导胚胎心脏生长方面发挥着重要作用。有趣的是，Pontin 在某些人类癌症中的表达会升高，并且与胚胎发育过程中的细胞增殖调控有关。然而，尽管已知 Pontin 在斑马鱼心脏发育中起着关键作用，但它在成年哺乳动物心脏中的具体作用仍不明确。鉴于了解心脏发育基因的作用，以及其可能为确定控制心脏不良重塑的新治疗靶点带来的潜在价值，第一作者单位的研究人员在本研究中对 Pontin 在心肌细胞和整个心脏中的作用展开了调查。研究人员发现，Pontin 在维持细胞活力以及调节病理性肥大生长（无论是基础状态下还是对应激刺激的反应中）方面起着关键作用，这可能是通过对 Hippo 通路的调节来实现的。

研究结果

Pontin 在成年心脏及病理状态下的表达

为了研究出生后哺乳动物心脏中 Pontin 的表达情况，第一作者单位的研究人员分析了野生型（WT）小鼠和大鼠的心脏组织。蛋白质免疫印迹分析表明，与成年大鼠心脏（12 周龄）相比，新生大鼠心脏（2 - 3 日龄）中 Pontin 的表达显著更高。在心脏受到压力刺激后，Pontin 的表达也会下降。在压力超负荷肥大模型中（如之前研究报道，该模型会使心脏重量与胫骨长度的比值增加 1.5 倍），研究人员发现，在进行主动脉弓缩窄（TAC）2 周后，WT 小鼠心脏中 Pontin 的表达显著降低。研究人员还评估了患有代谢综合征（表现为高血压、高血糖和肥胖等症状）的恒河猴心脏中 Pontin 的水平，发现患有代谢综合征的恒河猴心脏中 Pontin 水平显著降低。同样，研究人员在人类心力衰竭（详细临床情况见补充表 1）患者的心脏样本中也发现，Pontin 在蛋白质水平和 mRNA 水平均呈现出表达降低的趋势。

在细胞水平上，研究人员在心肌细胞和心脏成纤维细胞中均检测到了 Pontin 的表达，且在心脏成纤维细胞中的表达水平更高。在心肌细胞中，Pontin 主要存在于细胞质中，细胞核中的定位较少；而在心脏成纤维细胞中，Pontin 在细胞核和细胞质中均有分布，且在细胞核内高度富集。重要的是，用去氧肾上腺素（30 μM，处理 72 小时）处理心肌细胞（此前研究表明，该处理可使细胞肥大增加约 1.3 倍）后，与对照组相比，Pontin 的表达显著降低。然而，在受到压力刺激后，无论是心肌细胞还是心脏成纤维细胞中，Pontin 的亚细胞定位似乎并未发生改变。

与病理状态下的表达情况形成对比的是，在运动诱导的心脏肥大中，Pontin 的表达并未发生显著变化。对经过 4 周运动训练（每天游泳 90 分钟，持续 4 周，该训练可使心脏重量与体重的比值增加 30%）的小鼠心脏进行蛋白质免疫印迹分析，结果显示与未经训练的小鼠心脏相比，Pontin 的表达没有差异。

Pontin 对心肌细胞增殖的调节作用

鉴于 Pontin 在斑马鱼心脏发育中具有调节作用，第一作者单位的研究人员推测 Pontin 可能参与调节哺乳动物心肌细胞的增殖。因此，研究人员在新生大鼠心肌细胞（NRCM）中建立了 Pontin 过表达系统来探究这一问题。随后，研究人员分析了细胞增殖标记物，包括 EdU 掺入率、Ki67 和磷酸化组蛋白 H3（pHH3）的表达。研究结果显示，Pontin 过表达可促进 NRCM 的增殖。与之相符的是，当研究人员使用 siRNA 抑制 Pontin 的表达时，发现心肌细胞的增殖显著减少。

Pontin 对血管紧张素诱导的肥大反应的调节作用

基于上述发现，第一作者单位的研究人员进一步探究 Pontin 除了调节细胞增殖外，是否还对肥大生长具有调节作用。在基础状态下，Pontin 过表达或基因沉默对心肌细胞的大小没有影响。然而，在血管紧张素 II（Ang II，1 μM，处理 48 小时）刺激后，Pontin 过表达可减轻 Ang II 介导的肥大反应，而 Pontin 基因敲低则会加剧肥大反应，这一结果通过细胞大小测量得以证实。同样，使用 BNP - 荧光素酶报告基因分析发现，在 Ang II 刺激后，Pontin 过表达细胞中的 BNP - 荧光素酶信号较低，而缺乏 Pontin 的 NRCM 中的信号则较高，这表明 Pontin 在介导肥大生长方面可能发挥着重要作用。

Pontin 对细胞凋亡和氧化应激的保护作用

除了诱导肥大生长外，Ang - II 还可通过激活 AT1 和 AT2 受体诱导细胞凋亡。为了评估 Pontin 是否会影响 Ang II 依赖的细胞凋亡，第一作者单位的研究人员在过表达或缺乏 Pontin 的 NRCM 中，经 Ang II 刺激后进行了 TUNEL 检测。研究人员发现，Pontin 过表达细胞中的凋亡水平显著降低，而缺乏 Pontin 的 NRCM 中凋亡细胞的数量则明显增多。

在心肌细胞中，Ang II 诱导的细胞死亡可能是由于 NADPH 氧化酶激活，导致线粒体中活性氧（ROS）生成增加，从而引发氧化应激所致。因此，研究人员对 NRCM 进行了二氢乙啶（DHE）染色，以评估 Pontin 基因敲低和过表达心肌细胞中 ROS 的产生水平。与之前的数据一致，研究人员观察到 Pontin 过表达对降低 Ang - II 处理后的 ROS 水平具有保护作用，而该基因的敲低则会导致细胞内 ROS 水平升高。研究人员进一步通过检测过氧化物处理（200 μM，4 小时）诱导的氧化应激下的细胞活力发现，Pontin 过表达可提高细胞活力，而 Pontin 基因敲低则会导致 NRCM 活力下降。

Pontin 基因敲除在体内导致严重心肌病

上述数据表明，Pontin 可能在介导心肌细胞生长和存活方面发挥着至关重要的作用，因此了解 Pontin 在体内心脏中的作用具有重要意义。为了解决这一问题，第一作者单位的研究人员利用 αMHCMerCreMer（αMCM）/loxP 系统，构建了小鼠心肌细胞特异性可诱导 Pontin 基因敲除模型（PontinicKO）。PontinicKO 小鼠的构建细节在补充图 6 和方法部分有详细描述。研究人员使用未注射他莫昔芬的 αMCM - Pontinfloxed 小鼠，以及 αMCM 转基因小鼠（无论是否接受他莫昔芬治疗）作为对照。

通过向 αMCM - Pontinfloxed 小鼠腹腔注射 40 μg/kg 体重的他莫昔芬，实现了 Pontin 在心肌细胞中的诱导性敲除。蛋白质免疫印迹数据证实，从成年 PontinicKO 小鼠分离的心肌细胞中，Pontin 的表达降低了约 50 - 60%，而心脏成纤维细胞中 Pontin 的表达未发生改变，这表明实现了细胞特异性敲除。随后，研究人员在注射他莫昔芬后的第 1、3 和 4 周进行了系列超声心动图分析。研究人员发现，在注射他莫昔芬 4 周后，PontinicKO 小鼠的心脏功能（射血分数）显著降低。有趣的是，在注射他莫昔芬后的第 1 和 3 周，射血分数并未降低，这表明在第 3 至 4 周期间心脏功能出现了突然恶化。超声心动图参数分析表明，PontinicKO 小鼠存在左心室腔扩张和收缩期室壁厚度显著降低的情况。

Pontin 基因敲除导致心脏肥大、凋亡和纤维化增加

为了了解 Pontin 基因敲除小鼠心脏的病理变化，第一作者单位的研究人员在注射他莫昔芬后第 24 天处死小鼠，并对此时的心脏组织进行分析。研究人员发现，与对照组相比，Pontin 基因敲除小鼠的心脏明显增大，这通过心脏重量与体重（HW/BW）比值得以体现。Pontin 基因敲除小鼠的心肌细胞横截面积也比对照组更大，并且肥大标记物（ANP）的表达在 Pontin 基因敲除小鼠心脏中更高。

随后，研究人员进行了相关实验，以分析纤维化和细胞凋亡水平。通过对 Masson 三色染色组织切片的纤维化面积评估，以及对 Col1a 表达的分析，强烈表明 Pontin 基因敲除小鼠的纤维化水平增加。重要的是，TUNEL 检测表明，成年心脏中 Pontin 的缺失导致心肌细胞凋亡增加。此外，对主要凋亡调节因子表达的分析显示，促凋亡因子 Bad、Bax 和 Caspase - 3 的表达在 Pontin 基因敲除小鼠中显著增加，而 p53 和 Bcl - xL 的表达则未发生改变。

综合以上数据表明，成年心肌细胞中 Pontin 的缺失会诱导严重的不良重塑，其特征为心肌细胞肥大、凋亡和纤维化。

Pontin 基因敲除加剧了 Ang - II 刺激的影响

体外实验数据表明，Pontin 基因沉默会加剧 Ang - II 刺激的影响。因此，第一作者单位的研究人员在 Pontin 基因敲除小鼠中研究了 Ang - II 刺激的作用。从注射他莫昔芬后的第 7 天开始，使用微型渗透泵以 1.5 mg/kg 体重 / 天的剂量输注 Ang - II。超声心动图分析显示，在输注 Ang - II 后的第 4 天，Pontin 基因敲除小鼠的心脏功能严重下降。因此，研究人员在第 3 天终止实验，并在微型泵植入后的第 3 天进行终点表型分析。研究人员观察到，与对照组相比，Pontin 基因敲除小鼠的射血分数显著降低，尽管此时的肥大反应（HW/BW 比值、心肌细胞大小和 ANP 表达）和纤维化（Masson 三色染色和胶原蛋白 1 表达）没有差异。与基础表型一致，在输注 Ang - II 后的第 3 天，Pontin 基因敲除小鼠的细胞凋亡水平增加。

Pontin 基因敲除心脏的转录组模式 RNA 测序分析

为了深入了解 Pontin 基因敲除的机制，第一作者单位的研究人员对 Pontin 基因敲除小鼠的心脏进行了 RNA 测序分析。在注射他莫昔芬后的第 1 和 3 周，研究人员检测了总 RNA，以分析 Pontin 基因缺失后早期和晚期的基因表达模式变化。在第 1 周时，研究人员发现有 60 个基因上调，47 个基因下调（错误发现率（FDR）值 <0.05，log2 倍变化> 1 或 <-1）；而在第 3 周时，有 916 个基因上调，1051 个基因下调。在所有差异表达基因（DEGs）中，有 60 个基因在注射他莫昔芬后的第 1 和 3 周均存在差异调节。为了描述这些基因的功能，研究人员使用了基因本体分析。在两个时间点上差异最为显著的基因集，是与细胞周期和细胞分裂调节相关的基因。

此外，对差异表达基因的 Ingenuity 通路分析（IPA）显示，与细胞发育、细胞生长和增殖、细胞周期以及细胞死亡 / 存活相关的基因富集。这一发现促使研究人员分析了几种常见的、参与调节心肌细胞生长、肥大、增殖和凋亡的主要信号通路的活性。

研究人员使用 H9c2 心肌母细胞系进行此项研究。将报告 β - 连环蛋白（Wnt 通路）、NFκB、NFAT、YAP、STAT3 或 AP1 信号通路活性的荧光素酶构建体转染到 H9c2 细胞中，这些信号通路均已知参与调节心肌细胞的生长、增殖和 / 或存活。24 小时后，用表达 Pontin 的腺病毒或 siRNA 处理细胞以敲低 Pontin 的表达。48 小时后测量荧光素酶活性。结果显示，Pontin 过表达可显著诱导 YAP（Hippo 通路的主要效应因子）的活性，而 Pontin 基因敲低则会降低 YAP 的活性。NFAT 荧光素酶活性也受到差异调节，但仅在 Pontin 基因敲低模型中出现这种情况。

随后，研究人员进行了基因集富集分析（GSEA），以进一步评估 Hippo 通路在 Pontin 基因敲除中的作用。研究人员使用规范通路数据库发现，Pontin 基因缺失与 Hippo 通路成分的表达之间存在显著关联。

Pontin 基因敲除小鼠中 Hippo 通路成分的表达改变

基于 KEGG 数据库，第一作者单位的研究人员选择了已知的 Hippo 通路核心成分、下游效应因子、正调节因子和负调节因子相关基因。通过热图可以观察到，在 Pontin 基因敲除小鼠中，Hippo 通路核心成分和 YAP/TAZ 负调节因子的表达呈增加趋势，尤其是在注射他莫昔芬后的第 3 周。对选定基因（如 MST1、SAV1 和 MOB1，它们是 Hippo 通路的核心成分）的单独分析表明，在注射他莫昔芬 3 周后，这些基因的 mRNA 水平显著增加。

为了进一步验证 RNA 测序数据，研究人员对小鼠心脏中 Hippo 通路的几个成员进行了蛋白质表达检测。蛋白质免疫印迹分析证实，在 Pontin 基因敲除小鼠的心脏中，MST1 和 MOB1 的蛋白质表达增加，而 LATS1 和 YAP 的表达未发生改变。为了检测 Hippo 通路成分表达的增加是否会影响 YAP 的激活，研究人员对 Pontin 基因敲除小鼠的心脏组织切片进行了免疫组织化学分析。研究人员观察到，Pontin 基因敲除小鼠心脏切片中 YAP 磷酸化呈增加趋势，尽管未达到统计学显著性。这一数据表明，Pontin 基因敲除小鼠心脏中 YAP 的活性可能降低。由于 Hippo 通路和 YAP 与细胞凋亡的调节密切相关，这一发现或许可以解释研究人员在 Pontin 基因敲除小鼠中观察到的心脏表型。

Pontin 在心肌细胞中对 Hippo 通路的调节作用

为了进一步分析 Pontin 调节 Hippo 通路的机制，第一作者单位的研究人员在 NRCM 中进行了相关实验。研究人员使用荧光素酶报告基因监测 NRCM 中 YAP 的活性，发现 Pontin 过表达的 NRCM 中 YAP - 荧光素酶信号显著增强，而缺乏 Pontin 的 NRCM 中 YAP - 荧光素酶活性则降低。与之相符的是，在缺乏 Pontin 的 NRCM 中重新引入 Pontin 的表达，可挽救 YAP 的活性。此外，使用 GFP - YAP 构建体分析 YAP 核转位发现，Pontin 过表达细胞中 YAP 阳性细胞核的数量增加，而缺乏 Pontin 的 NRCM 中核 YAP 水平较低。重要的是，蛋白质免疫印迹分析显示，Pontin 过表达可增加活性 YAP 的水平，并降低磷酸化 YAP 的表达，而 Pontin 基因敲低则会降低活性 YAP 的水平，并增加磷酸化 YAP 的表达。

为了确定 YAP 调节是 Pontin 表达下调导致相关表型的机制，研究人员使用之前开发的组成型活性 YAP（YAP^{S227A}）诱导表达系统进行了 YAP 挽救实验。通过强力霉素处理诱导 YAP^{S227A} 在 Pontin 缺陷型心肌细胞中的表达。结果显示，YAP^{S