重大突破！整合网络药理学、分子对接及实验验证，深度解析鞣酸治疗鼻咽癌全新机制

为解决鼻咽癌治疗难题，南华大学衡阳医学院附属长沙中心医院的研究人员开展鞣酸（TA）治疗鼻咽癌机制的研究。结果发现 TA 可靶向 PI3K/AKT 通路抑制 NPC 细胞增殖。该研究为鼻咽癌治疗提供新思路，极具科研价值，推荐阅读。

　　

南华大学衡阳医学院附属长沙中心医院的研究人员 Meiwei Wang、Longmei He 和 Pan Yan 在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Integrated network pharmacology, molecular docking and experimental validation to investigate the mechanism of tannic acid in nasopharyngeal cancer” 的论文。这篇论文在鼻咽癌治疗研究领域意义重大，为开发新的鼻咽癌治疗药物提供了重要依据，有助于推动鼻咽癌治疗的发展，改善患者的治疗现状。

论文的摘要指出，鞣酸（Tannic acid，TA）是五倍子（Galla chinensis）的主要生物活性成分，具有抗癌作用，然而其在鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）中的抗癌机制尚不清楚。本研究通过网络药理学、分子对接和实验验证，探究 TA 治疗鼻咽癌的潜在机制。研究发现，NPC 相关靶点和 TA 相关靶点之间有 42 个交集靶点，磷脂酰肌醇 3 - 激酶（Phosphoinositide 3 - kinase，PI3K）/ 蛋白激酶 B（Protein kinase B，AKT）信号通路是 TA 抗 NPC 的主要靶点通路。分子对接和分子动力学模拟证实了 TA 与 AKT1 的紧密结合亲和力。体外实验表明，TA 通过靶向 PI3K/AKT 信号通路发挥抗 NPC 的抗癌活性，抑制细胞增殖。这表明 TA 有望成为治疗 NPC 的候选药物，为其临床应用提供了新的思路。

鼻咽癌是一种起源于鼻咽黏膜的致命上皮肿瘤，具有明显的地域分布特征，在北非和东南亚地区较为常见。其组织学亚型通常有基底样癌、角化鳞状细胞癌和非角化癌三种。鼻咽癌的病因与爱泼斯坦 - 巴尔病毒（Epstein - Barr virus）感染、遗传和环境因素有关，且男性发病率较高，男女比例约为 2.5:1。尽管随着生活方式和环境的改变、对发病风险认知的提高、成像技术的快速发展以及放化疗策略的优化，鼻咽癌的发病率和死亡率逐渐下降，但仍有部分患者会出现复发，死于远处转移或局部区域复发。目前，复发鼻咽癌的理想治疗方法是铂类联合化疗，但由于放疗抵抗和放疗后肿瘤复发，一些患者的治疗效果并不理想。因此，迫切需要探索对患者副作用小的潜在抗鼻咽癌方法。

天然产物作为抗癌药物展现出了巨大的潜力。五倍子是一种在东亚和东南亚国家用于治疗多种疾病的草药，具有抗病毒、抗癌、抗菌、抗氧化和护肝等多种活性。TA 作为五倍子的主要生物活性成分，在医学领域有多种药理应用，近年来研究发现其对多种恶性肿瘤具有潜在抗癌活性，在鼻咽癌治疗方面也有一定潜力，但 TA 治疗鼻咽癌的确切机制尚未完全阐明。

网络药理学是一种新兴的方法，通过探索涉及多种成分、靶点和途径的潜在机制来阐明药物对各种疾病的治疗作用。分子对接策略则基于高通量筛选数据库，阐明药物与靶分子相互作用的潜在生化过程。本研究将网络药理学、分子对接和实验方法相结合，以揭示 TA 治疗 NPC 的活性成分和潜在机制。

研究人员首先从 TTD、OMIM、DisGeNET 和 GeneCards 四个数据库中，使用关键词 “Nasopharyngeal carcinoma” 识别 NPC 相关靶点；从 BATMAN - TCM、HERB、DrugCentral、HIT 和 Pharmmapper 数据库中，使用关键词 “Tannic acid” 搜索 TA 相关靶点，并通过 UniProt 将 TA 相关靶点映射到基因名称。最终确定 NPC 相关靶点和 TA 相关靶点的交集靶点，这些交集靶点即为 TA 抗 NPC 的潜在靶点。

利用确定的潜在靶点构建化合物 - 靶点 - 疾病（Compound - Target - Disease，C - T - D）网络，每个节点分别代表 TA、潜在靶点和 NPC。在 STRING 数据库中，设置最小相互作用分数为中等置信度（0.400），建立潜在靶点的蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein - Protein Interaction，PPI）网络。然后使用 Cytoscape 软件的插件 CytoHubba 识别 PPI 网络中的枢纽节点（hub nodes）。

运用 FunRich 软件（配备自定义数据库 DAVID，版本 6.8）进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析，使用 Hiplot 进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

从公共功能基因组学数据库 Gene Expression Omnibus（GEO）获取 GSE53819 数据集，使用 GEO2R 工具分析 NPC 标本和正常组织中枢纽基因的表达水平差异。

使用 AutoDock Vina 验证 TA 与关键靶点之间的分子间亲和力。从 PDB 数据库检索受体的三维结构，从 ChemSpider 数据库获取 TA 的结构，用 Chem3D 软件优化配体能量，再用 AutoDock Tools 对配体和受体进行处理，计算配体电荷、定义其位置和旋转键数量等，最后在封装活性位点的三维网格盒中进行对接，使用 PyMOL 和 LigPlot?软件可视化和分析对接结果，并采用 Pathania 等人的方法验证对接协议。

运用分子动力学（Molecular Dynamics，MD）技术，使用 GROMACS（版本 2020.6）验证蛋白质 - 配体复合物的稳定性。通过 AMBER99SB - ILDN 力场生成蛋白质拓扑文件，使用 General AMBER Force Field（GAFF）和 Sobtop 创建配体拓扑文件，采用 SPC 水立方模型进行溶剂化处理，添加 Na?/Cl?离子中和系统电荷，先后使用最速下降法和共轭梯度法进行能量最小化，在 300K 下分别进行 2ns 的等温等容（NVT）和等温等压（NPT）模拟使系统达到所需温度和压力平衡，最后进行 100ns 的 MD 模拟。

研究人员从美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）获取人 NPC 细胞系 5 - 8F 和 6 - 10B，并按照之前研究描述的条件进行细胞培养。

将细胞以每孔 1×10?个细胞的密度接种于含 DMEM 培养基的 96 孔板中，培养 24h 后，用不同浓度（0、10、20、40、60、80μM）的 TA 处理 24 - 48h。处理结束后，更换为含 10μL CCK - 8 试剂的新鲜 DMEM 培养基，继续培养 2h，最后用酶标仪在 450nm 处测量整个孔板的吸光度。每个处理组设置 6 个重复，实验重复 3 次。

将 NPC 细胞以每孔 800 个细胞的密度接种于 6 孔板中，细胞贴壁 24h 后，加入不同剂量（0、10、20、40、60μM）的 TA 处理 48h，之后更换为新鲜培养基，继续培养 14 天。最后用 4% 多聚甲醛在 4°C 固定细胞 10min，用 0.1% 结晶紫试剂染色 20min，去除溶液并使细胞干燥后，用 Image pro plus 软件拍摄并分析每孔细胞的图像。

将细胞接种于 6 孔细胞板中，培养至 90% 汇合度，用 200μL 移液器吸头手动在细胞单层上划痕，用 PBS 溶液洗涤 3 次以去除多余的脱落细胞，加入不同浓度（0、10、20、40、60、80μM）的 TA，在 TA 处理后 0、24 和 48h 用显微镜拍摄划痕图像，使用 Image Pro Plus 软件量化伤口愈合情况，通过计算指定时间点的伤口面积与 0h 伤口面积的差值除以 0h 伤口宽度，得到伤口闭合百分比。

用含有蛋白酶抑制剂的蛋白质提取试剂裂解 NPC 细胞，使用 BCA 浓度试剂盒标准化样品的蛋白质浓度，通过 SDS - PAGE 电泳分离蛋白质，转移至 PVDF 膜上，用 3% 脱脂奶粉封闭 1h，在 4°C 与一抗孵育 12h，然后在 25°C 与二抗孵育 2h，使用化学成像系统曝光 PVDF 膜，用 Image pro plus 软件计算每个凝胶的灰度值。

所有数据以平均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，使用单因素方差分析（one - way ANOVA）进行统计分析，使用 SPSS 软件版本 22（SPSS Inc., Chicago, USA）进行所有分析，使用 GraphPad Prism 8.0 软件（GraphPad Instruments, USA）生成统计图表，P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

通过上述关键词搜索，研究人员从 GeneCards、DisGeNET、TTD 和 OMIM 数据库中鉴定出 1095 个 NPC 相关靶点，从 BATMAN - TCM、DrugCentral、HERB、HIT 和 Pharmmapper 数据库中预测出 160 个 TA 相关靶点，经过标准化处理后，确定了 42 个 NPC 相关靶点和 TA 相关靶点的交集靶点，这些即为 TA 抗 NPC 的潜在靶点，并构建了 C - T - D 网络。

以 42 个 TA 抗 NPC 的潜在靶点构建 PPI 网络，由于 ABO 靶点与其他靶点缺乏相互作用而被排除，最终 PPI 网络由 41 个基因和 287 个相互作用组成。通过 CytoHubba 筛选出枢纽基因，包括 AKT1、PTGS2、IGF1、HSP90AA1、HRAS、CCND1、MMP9、MAPK3、ALB 和 SRC，这些基因可能参与 TA 抗 NPC 的机制。

GO 分析结果显示，在细胞成分相关项目中，主要包括细胞质、胞质溶胶、线粒体和细胞质核周区域，这些与鼻咽癌癌细胞干细胞的代谢转变和线粒体重置密切相关；分子功能相关项目主要与激酶活性、蛋白激酶活性和 ATP 结合有关，提示 TA 可能作为潜在的 ATP 抑制剂与蛋白激酶（如蛋白激酶 B）的活性位点结合用于癌症治疗；生物过程相关项目主要涉及蛋白质自磷酸化、脂多糖介导的信号通路、肽基 - 丝氨酸磷酸化和蛋白质磷酸化，而磷酸化与癌症的发生和发展相关，参与调节细胞生长、增殖、死亡、代谢和信号转导等过程。KEGG 分析结果表明，PI3K - Akt 信号通路显著富集，该通路在 NPC 细胞迁移中起关键作用。

通过 GEO 数据库对枢纽基因 AKT1、CCND1、IGF1、HSP90AA1 和 HRAS 的表达水平进行外部验证。GEO2R 分析显示，与正常组织相比，NPC 组织中 AKT1、CCND1 和 HRAS 的表达水平显著上调，IGF1 的表达水平显著下调，HSP90AA1 的表达水平在 NPC 和正常组织之间无显著差异。

KEGG 分析暗示 TA 可能通过调节 NPC 中的 PI3K - Akt 信号通路发挥作用，AKT1 作为 TA 抗 NPC 的枢纽基因，在 NPC 和正常组织中的表达水平存在显著差异，因此研究人员选择 AKT1（PDB: 4GV1）作为关键靶点进行分子对接验证。实验和对接的配体构象表明对接协议具有较高的可靠性，理论上结合能越低的配体 - 受体复合物被认为构型越稳定，对接结果显示 TA 与 AKT1 具有良好的亲和力，结合能为 - 9.9kcal/mol。在与 AKT1 的相互作用中，TA 通过氢键与 THR - 160、GLY - 162、GLU - 228、ALA - 230、ASP - 274、ASP - 292、THR - 312 和 ASP - 439 结合，间接证实了 KEGG 分析的结果。

为了验证对接结果，对 AKT1 - TA 复合物进行 100ns 的 MD 模拟。均方根偏差（Root Mean Square Deviation，RMSD）曲线可以动态反映蛋白质和配体构象的波动，结果显示 AKT1 - TA 复合物在 60ns 后达到相对平衡，RMSD 结果表明 TA 可以稳定地与 AKT1 结合。

基于网络药理学和分子对接的结果，研究人员通过体外实验进一步探究和验证 TA 对 NPC 的潜在治疗作用。结果显示，TA 处理显著抑制了 5 - 8F 和 6 - 10B 细胞的活力，且呈时间依赖性。5 - 8F 细胞在 40 - 80μM TA 处理 24h 后活力下降，48h 时相同浓度下活力明显降低；6 - 10B 细胞在 40 - 80μM TA 处理 24h 后活力受到抑制，20 - 80μM TA 处理 48h 后活力下降。同时，细胞形态也发生了相应改变。

TA 对 NPC 细胞的集落形成能力具有剂量依赖性抑制作用，随着 TA 浓度从 20μM 增加到 60μM，NPC 细胞形成的集落数量逐渐减少。

伤口愈合实验结果表明，TA 明显抑制 NPC 细胞的伤口闭合，且呈剂量依赖性。在 24h 处理后，较高浓度（40 - 60μM）的 TA 可降低 NPC 细胞的伤口愈合能力；在 48h 处理后，较低剂量的 TA 也能抑制 NPC 细胞的伤口闭合。

上述体外实验结果表明 TA 对 NPC 细胞的活力、集落形成和伤口闭合具有抑制作用，结合 KEGG 分析、GEO 分析和分子对接结果，推测 TA 可能调节 NPC 中的 PI3K/AKT 信号通路。进一步研究发现，TA 显著降低了 NPC 细胞中 p - AKT/AKT 的蛋白表达比例，在 40μM 浓度下抑制了 p - PI3K/PI3K 的蛋白表达水平。用 PI3K 抑制剂（LY294002，10μm）预处理 NPC 细胞 30min 后再用 TA 处理，与单独使用 TA 组相比，细胞活力和伤口闭合能力显著降低，这表明 TA 可能通过抑制 PI3K/AKT 信号通路发挥其在 NPC 中的抗癌作用。

研究人员通过网络药理学和分子对接初步预测了 TA 治疗 NPC 的交集靶点和主要靶点通路，体外实验进一步证实了 TA 抑制 NPC 细胞增殖并抑制 PI3K/AKT 信号通路，从而确认了 TA 的抗肿瘤药理作用。这一研究为鼻咽癌的治疗提供了新的潜在药物选择，为开发基于 TA 的鼻咽癌治疗方案奠定了基础，有望推动鼻咽癌治疗领域的发展，改善患者的预后。

TA 作为五倍子的主要生物活性成分，具有显著的抗氧化和抗癌活性，在药物研究中备受关注。本研究通过综合运用网络药理学、分子对接和实验验证等方法，全面深入地探究了 TA 治疗 NPC 的潜在机制。网络药理学分析构建了 TA - NPC 目标网络，确定了关键靶点和 PI3K/AKT 信号通路；分子对接结果显示 TA 与 PI3K/AKT 通路的靶蛋白紧密结合；体外实验则有力地证实了 TA 通过抑制 PI3K/AKT 信号通路抑制 NPC 细胞增殖。这些研究结果不仅揭示了 TA 治疗 NPC 的分子机制，还为 TA 在临床治疗 NPC 中的应用提供了坚实的理论和实验依据，为未来开发更有效的鼻咽癌治疗策略开辟了新方向，具有重要的科学价值和临床意义 。