细胞外囊泡高效递送 SMN 蛋白新突破：为脊髓性肌萎缩症治疗带来曙光

为解决脊髓性肌萎缩症（SMA）现有疗法的不足，加拿大渥太华医院研究所的研究人员开展细胞外囊泡（EVs）递送生存运动神经元（SMN）蛋白的研究。结果显示 EVs 能有效将 SMN 蛋白递送至细胞，该成果为 SMA 治疗带来新希望，值得科研人员一读。

　　

加拿大渥太华医院研究所再生医学项目（Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute）的 Charlotte A. René 和 Robin J. Parks 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Extracellular vesicles efficiently deliver survival motor neuron protein to cells in culture” 的论文。这篇论文在脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）的治疗研究领域意义重大，为开发新的治疗策略提供了重要的理论依据和实践方向。

研究背景

SMA 是一种由生存运动神经元 1（survival motor neuron 1，SMN1）基因的纯合突变或缺失引起的遗传性神经肌肉疾病。这会导致细胞内 SMN 蛋白数量减少，进而优先引起运动神经元死亡，最终造成肌肉萎缩。除此之外，SMN 蛋白的缺乏还会对心脏、肝脏、胸腺等许多外周组织产生不良影响。对于最常见且严重的 I 型 SMA 患者而言，如果不进行治疗，通常会在 8 个月左右因呼吸衰竭而死亡。

目前已有几种治疗 SMA 的方法，它们都致力于提高细胞内 SMN 蛋白的水平。然而，这些疗法都存在一定的问题。比如，Nusinersen 是一种反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO），它能促进 SMN2 前体 mRNA 中外显子 7 的包含，从而增加全长蛋白的产生。但患者对其治疗反应不一，近 50% 的患者在临床试验中没有反应，而且还存在凝血异常、肾毒性等风险。Risdiplam 通过调节 SMN2 前体 mRNA 的剪接来增加全长 SMN 蛋白的产生，虽然能改善运动功能，但效果不如 Nusinersen，并且在动物模型中发现它会导致视网膜毒性和其他基因的脱靶剪接。Onasemnogene abeparvovec 是一种腺相关病毒（adeno - associated virus，AAV）基因治疗药物，虽能让许多患儿获得新的运动里程碑，减少对永久通气的需求，但由于其高剂量使用，会引发如血栓性微血管病、坏死性小肠结肠炎和急性肝衰竭等严重不良事件。因此，开发新的治疗方法迫在眉睫。

SMN 蛋白在细胞的细胞核和细胞质中都存在，在细胞核中它定位于称为 Gemini of coiled bodies（gems）的结构中，与 Gemin2 - 8 蛋白和 Unrip 相互作用，形成 SMN 复合物，该复合物对小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs）的组装至关重要，而 snRNPs 对于前体信使核糖核酸（pre - messenger ribonucleic acid，pre - mRNA）的剪接不可或缺。此外，SMN 复合物还可能参与小核仁核糖核蛋白（small nucleolar ribonucleoproteins，snoRNPs）的组装以及端粒酶相关的功能。不过，SMN 蛋白在 SMA 发病机制中的确切细胞作用仍不明确。

值得注意的是，SMN 蛋白能自然地被装载到细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）中。EVs 是一种亚微米大小、膜包裹的颗粒，由所有细胞类型释放到体液或组织培养液中。根据生物发生机制和直径，EVs 可分为多种类型，其中研究最广泛的是外泌体（exosomes）和微颗粒（microparticles）。EVs 携带蛋白质、核酸和脂质等生物分子，能够将这些物质传递给摄取它们的受体细胞，而且具有脂质双层保护内容物不被血液降解、能穿过血脑屏障（blood - brain barrier，BBB）以及可进行生物工程改造以增加治疗性货物装载量等优点，因此在许多研究中被成功用于递送各种治疗性蛋白质。基于此，研究人员推测利用 EVs 递送 SMN 蛋白可能是治疗 SMA 的新途径，进而开展了此项研究。

研究方法

1. 细胞培养：分别培养 A549 细胞、A549:HA - Gemin2 细胞（稳定表达 N 端 HA 标记的 Gemin2 蛋白）、HepG2 细胞和 HepG2:3F - SMN 细胞（稳定表达 N 端三重 FLAG 标记的 SMN 蛋白），以及从 SMA 患者获取的成纤维细胞。培养条件根据细胞类型的不同，在相应的培养基中添加胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、GlutaMAX 和抗生素等，并在 37°C、5% 的湿润培养箱中培养。
2. 病毒感染：构建 Ad3F - SMN（一种缺失早期区域 1（E1）和 E3，含有驱动三重 FLAG 标记的 SMN1 cDNA 表达的腺病毒载体）和 AdmCherry - SMN（含有驱动 mCherry 标记的 SMN1 cDNA 表达的腺病毒载体），用它们以不同的感染复数（multiplicity of infection，MOI）感染 HepG2 细胞，同时设置 PBS mock 感染的对照组，感染 1 小时后洗涤细胞，72 小时后收集细胞裂解物和条件培养基（conditioned medium，CM）。
3. 细胞外囊泡的分离：从 CM 中分离 EVs，对于 HepG2 或 HepG2:3F - SMN 细胞，采用差速超速离心法。先将 CM 低速离心去除凋亡小体和细胞碎片，然后超速离心收集 EVs，再进行二次超速离心洗涤，最后将沉淀重悬于 PBS 中保存。对于感染 Ad3F - SMN 的 HepG2 细胞，还使用了基于聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的方法分离 EVs。通过纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）测定 EVs 的浓度和直径。
4. 条件培养基处理：在进行培养基转移实验时，先对 CM 进行低速离心去除细胞碎片和大的 EVs，然后将其用于处理受体细胞。对于需要进行免疫荧光染色的受体细胞，先在特定条件下预处理，再用含有或不含有 5,6 - 二氯 - 1 - β - D - 呋喃核糖基苯并咪唑（5,6 - dichloro - 1 - β - D - ribofuranosylbenzimidazole，DRB，一种 RNA 聚合酶转录延伸抑制剂）的 CM 处理 2 小时，之后进行免疫荧光染色和分析。
5. 共免疫沉淀：将细胞裂解后，取一定量的裂解液与相应的抗体（如抗 FLAG、抗 HA 等）在 4°C 下孵育过夜，然后加入蛋白 G 或蛋白 A 磁珠，孵育 90 分钟，分离结合和未结合的部分，用于后续的免疫印迹分析，以检测蛋白之间的相互作用。
6. 免疫印迹：将细胞和 EVs 裂解后，进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis，SDS - PAGE），然后将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，用相应的抗体进行检测，最后通过成像系统观察结果。
7. 免疫荧光染色和显微镜观察：对细胞进行固定、通透化和封闭处理后，与相应的抗体孵育，再用荧光标记的二抗孵育，并用 Hoechst 33342 染色以显示细胞核。使用蔡司 Axio Imager M2 直立显微镜或蔡司 LSM 900 倒置共聚焦显微镜观察并采集图像，通过 FIJI 软件处理图像，利用 CellProfiler 软件对图像中的荧光强度进行量化，对细胞核中的 gem 数量进行统计分析。
8. 统计分析：使用 Prism 9.1.0 软件进行统计分析，根据数据特点选择合适的参数检验方法，数据以平均值 ± 标准差表示，通过不同的显著性标记（如 * 表示span data-custom-copy-text="\(p0.05\)"，** 表示span data-custom-copy-text="\(p0.01\)"等）展示分析结果。

研究结果

1. 开发和表征用于生产装载 SMN 蛋白的细胞外囊泡的供体细胞系：研究人员构建了稳定表达三重 FLAG 标记的 SMN（3F - SMN）蛋白的 HepG2:3F - SMN 细胞系。免疫印迹分析显示，该细胞系中总 SMN 蛋白水平比亲本 HepG2 细胞中内源性 SMN 蛋白水平高约 1.5 倍。共免疫沉淀实验证实，N 端三重 FLAG 标签不会干扰 3F - SMN 蛋白与内源性 SMN 蛋白和 Gemin2 蛋白的相互作用。免疫荧光结果表明，3F - SMN 蛋白在细胞中的定位与内源性 SMN 蛋白一致，且 HepG2:3F - SMN 细胞中每 100 个细胞的 gem 平均数量显著增加，说明该细胞系成功构建，且蛋白定位和相互作用正常。对 HepG2:3F - SMN 细胞系释放的 EVs 进行表征，NTA 分析发现，从 HepG2 和 HepG2:3F - SMN 细胞系分离的 EVs 在大小和浓度上没有显著差异，峰值粒径分别为 87nm 和 91nm。免疫印迹显示，HepG2:3F - SMN 细胞系释放的 EVs 中含有 3F - SMN 蛋白，且其 SMN 蛋白信号强度比亲本 HepG2 细胞释放的 EVs 高约 2.5 倍，表明 3xFLAG 标签不影响 SMN 蛋白被整合到 EVs 中。
2. 生成含有 HA 标记的 Gemin2 的受体细胞系：为了区分递送的 3F - SMN 蛋白与受体细胞内源性 Gemin2 蛋白，研究人员构建了稳定表达 HA 标记的 Gemin2 蛋白的 A549:HA - Gemin2 细胞系。免疫印迹表明，HA 标记的 Gemin2 蛋白表达水平与内源性蛋白相近，且能与 SMN 蛋白相互作用。免疫荧光显示，HA 标记的 Gemin2 蛋白在细胞中的定位与内源性蛋白相似，且 A549:HA - Gemin2 细胞中含 SMN 的核 gem 数量比亲本 A549 细胞少，这可能是由于过表达的 Gemin2 蛋白使部分内源性 SMN 蛋白重新定位到细胞质中，但总体而言，A549:HA - Gemin2 细胞系适合用于评估 EV 介导的 3F - SMN 蛋白递送。
3. 通过腺病毒载体介导的过表达增强细胞外囊泡中 3F - SMN 蛋白的数量：最初，研究人员尝试用 HepG2:3F - SMN 细胞的 CM 处理 A549:HA - Gemin2 细胞，无法检测到 FLAG 阳性信号。后来发现，通过超速离心浓缩 EVs 约 200 倍后虽能检测到信号，但信号主要为细胞表面的大聚集体，无法确定蛋白的内化和正确定位。于是，研究人员利用 Ad 介导的过表达技术，用 Ad3F - SMN 以不同 MOI 感染 HepG2 细胞。结果显示，感染导致细胞内 3F - SMN 蛋白数量呈剂量依赖性增加，细胞内总 SMN 蛋白增加了 15 - 25 倍，从感染细胞的 CM 中分离的 EVs 中 SMN 蛋白含量在最高 MOI 时增加了超过 20 倍，且 Ad 转导对 HepG2 细胞释放 EVs 的浓度和大小分布没有明显影响，表明 Ad 介导的 SMN 蛋白过表达可显著提高 EVs 中 SMN 蛋白的浓度。在后续研究中，“3F - SMN ” 表示从感染 Ad3F - SMN 且 MOI = 200 的 HepG2 细胞收集的 CM。
4. 细胞外囊泡可以将 SMN 蛋白递送到受体细胞：研究人员用感染 Ad3F - SMN（MOI = 200）或 mock 感染的 HepG2 细胞的 CM 处理 A549:HA - Gemin2 细胞。为了排除残留 Ad3F - SMN 载体导致 A549:HA - Gemin2 细胞从头合成 3F - SMN 蛋白的干扰，采取了两种策略：一是将 CM 孵育时间限制在 2 小时，二是在孵育时添加 DRB。免疫荧光显微镜观察发现，在 mock 处理组中未检测到 FLAG 信号，而在 3F - SMN CM 处理组中，DRB 处理组和未处理组都能检测到 FLAG 阳性核焦点，表明至少部分递送的 3F - SMN 蛋白定位于细胞核。共聚焦显微镜和正交投影分析进一步显示，3F - SMN CM 处理后，3F - SMN 蛋白存在于细胞核中类似核 gem 的特定焦点中，且与 HA - Gemin2 蛋白共定位。此外，研究人员还用 AdmCherry - SMN 感染 HepG2 细胞，收集 CM 处理亲本 A549 细胞，发现 mCherry - SMN 蛋白也能定位于细胞核中的核 gem 样结构。最后，用 3F - SMN CM 处理 SMA 患者来源的成纤维细胞，同样观察到 3F - SMN 蛋白在细胞质和细胞核中存在，且细胞核中有类似核 gem 的 FLAG 阳性焦点。综合以上结果，表明 EVs 能够有效地将 SMN 蛋白递送到受体细胞，包括 SMN 蛋白水平较低的细胞，使蛋白在细胞质和细胞核的 gem 样结构中积累。

研究结论与讨论

研究人员通过一系列实验证明了 EVs 可以将 SMN 蛋白递送到组织培养中的受体细胞，并且递送的 SMN 蛋白能够定位于细胞核，与正常细胞蛋白伙伴相互作用，发挥类似于内源性 SMN 蛋白的功能。这一发现为 SMA 的治疗提供了一种全新的方法，即利用装载 SMN 蛋白的 EVs 来补充患者细胞内缺乏的 SMN 蛋白，有望成为治疗 SMA 的潜在新策略。

从治疗角度来看，EV 介导的 SMN 蛋白递送具有诸多优势。EVs 能够自然穿过血脑屏障，将货物有效地递送到中枢神经系统（central nervous system，CNS）的受体细胞，而且在体内，系统给药的 EVs 可以将货物递送到包括大脑、心脏、肾脏、肺和骨骼肌等多种组织的细胞中，因此装载 SMN 蛋白的 EVs 有可能补充 SMA 患者多种细胞类型中的 SMN 蛋白水平。虽然 SMN 蛋白的半衰期约为 6 小时，可能需要每日注射 SMN 装载的 EVs 以确保治疗效果，但目前已有多种方法可用于制备大规模治疗所需的 EVs，如切向流过滤（tangential flow filtration，TFF）技术可以有效地从大量生物流体中纯化 EVs。此外，EVs 在治疗 COVID - 19 引起的肺炎、呼吸衰竭、癌症和伤口愈合等方面的临床试验中已显示出安全性，而且其具有相对稳定的保质期和低免疫原性等优点。

不仅如此，装载 SMN 蛋白的 EVs 还可以作为一种暂时或补充性的治疗手段。在 SMA 患者的治疗过程中，从确诊到开始治疗通常存在 1 - 2 个月的延迟期，在此期间患者的病情可能会继续恶化，而 SMN 装载的 EVs 可以在这段时间内提供 SMN 蛋白。另外，对于正在接受 Nusinersen 和 / 或 Risdiplam 治疗但反应不佳的患者，补充 SMN 蛋白治疗可能会增强这些药物的治疗效果。而且，研究还发现目前批准的三种 SMA 治疗方法可能部分通过在肝脏等外周组织产生 SMN 蛋白，进而释放含有 SMN 蛋白的 EVs，被全身组织摄取来发挥治疗作用，这表明治疗药物不一定需要直接靶向中枢神经系统，外周组织可以作为生产治疗性 EVs 的 “工厂”，为全身组织包括中枢神经系统提供治疗性蛋白，这为其他疾病的治疗也提供了新的思路。

综上所述，该研究为 SMA 的治疗开辟了新的方向，虽然将 EV 介导的 SMN 蛋白递送转化为临床治疗还需要进一步研究和验证，但这一成果无疑为 SMA 患者带来了新的希望，也为神经肌肉疾病的治疗研究注入了新的活力，推动了相关领域的发展。