BRD4 相互作用基因：肝细胞癌精准诊疗的前沿预后标志物与联合治疗新策略

为解决肝细胞癌（HCC）早期诊断困难和治疗耐药问题，郑州大学第一附属医院的研究人员开展 BRD4 相关基因研究。他们构建四基因预后模型，发现联合抑制剂可增效。这为 HCC 诊疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

郑州大学第一附属医院（Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University）的研究人员 Huapeng Zhang、Jie Yu 等在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “BRD4 interacting genes as prognostic biomarkers in hepatocellular carcinoma for optimized treatment strategies” 的论文。这篇论文在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）研究领域意义重大，为该疾病的早期诊断、个性化治疗以及克服耐药性等方面提供了全新的思路和方法 。

一、研究背景

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，发病率呈上升趋势，尤其在男性中更为普遍。其发病与病毒性肝炎（如乙肝 HBV、丙肝 HCV ）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH），以及酗酒、吸烟、糖尿病等因素相关。尽管治疗手段不断进步，但由于 HCC 的复杂性，患者五年生存率仍低于 20%，且流行病学特征的变化给早期诊断带来了巨大挑战。

BRD4 是 BET 家族蛋白成员，通过其溴结构域与乙酰化染色质相互作用来调节基因表达，在维持基因组完整性、DNA 修复、调节细胞死亡和端粒长度等方面发挥着关键作用。此前研究发现，HCC 组织中 BRD4 表达升高，抑制 BRD4 可抑制 HCC 细胞系增殖、诱导细胞凋亡并减缓小鼠 HCC 异种移植模型中的肿瘤生长。然而，BRD4 及其相关基因对 HCC 的影响尚不清楚，且 BRD4 抑制剂在实体瘤治疗中面临耐药性问题。鉴于 BRD4 与多种转录因子和表观遗传调节蛋白相互作用形成复杂网络，探索 BRD4 抑制剂与其他相关蛋白抑制剂的联合治疗方案，有望提高治疗效果并减轻耐药性，因此开展此项研究意义重大。

二、研究方法

1. 数据采集：从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库获取 377 例 TCGA-LIHC HCC 患者的 RNA 测序数据和临床信息，同时从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）和 EMBL-EBI 分别获取 GSE14520 和 E-TABM-36 数据集。基于癌症药物敏感性基因组学（Genomics of Drug Sensitivity in Cancer，GDSC）数据库进行药物反应预测，BRD4 相互作用基因集来自 BioGRID 数据库。
2. 预后基因初步筛选：利用 “DESeq2” R 包处理 TCGA-LIHC 数据集，筛选出 | log2FC|≥2 的差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），并与 BRD4 相互作用基因集进行交集分析。使用 Hiplot 绘制火山图和维恩图，通过 STRING 数据库构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络。
3. 风险评分模型构建与验证：运用最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator，LASSO）算法结合交叉验证优化 λ 参数，筛选预后相关特征基因。借助 R 包 “survival” 和 “glmnet” 构建风险评分模型（Risk ）。使用 “survival” 和 “survminer” 进行生存分析，通过 “pROC” 包计算曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）评估模型区分度，利用 “rms”“caret” 和 “replot” 包校准列线图。
4. 富集分析与体细胞突变分析：采用基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）评估不同通路中基因集表达的变化，通过 “GSVA” 包计算高低风险组的通路富集分数。分别使用 Metascape 和 KOBAS 进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析（span data-custom-copy-text="\(P0.05\)"为有统计学意义）。利用在线平台分析 TCGA-LIHC 数据集的体细胞突变谱。
5. 肿瘤微环境分析与药物敏感性预测：运用 TIMER、MCP-COUNTER、EPIC 和 CIBERSORT 算法分析基因表达和免疫细胞浸润情况，通过 ESTIMATE 算法确定免疫和基质评分。采用肿瘤免疫功能障碍和排除（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion，TIDE）方法评估免疫治疗反应潜力，使用 “oncopredict” 包分析药物敏感性。
6. 药物处理与细胞培养：从中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）获取 MHCC-97 H 和 HepG2 细胞系。在 37°C、5% 条件下，MHCC-97 H 细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中培养，HepG2 细胞在 MEM 培养基中培养。药物处理包括 ZBC260（10 nM/mL）、CPI-169（5 μg/mL）单药处理以及二者联合处理（5 nM/mL ZBC260，2.5 μg/mL CPI-169）。使用多个 R 包进行转录因子基序富集分析。
7. 蛋白检测与细胞功能检测：按照标准程序进行蛋白质免疫印迹（Western blot），使用特定抗体检测蛋白表达，通过化学发光法显影。利用细胞计数试剂盒 - 8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测细胞活力，使用 Annexin V-PE 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。
8. 统计分析：使用 R（版本 4.1.2）和 GraphPad Prism（版本 8.0.1）进行统计分析。数据以均值 ± 标准差表示，组间比较采用两尾 Student's t 检验、卡方检验或单因素方差分析（ANOVA），span data-custom-copy-text="\(P0.05\)"具有统计学意义（span data-custom-copy-text="\(*P0.05\)" ，span data-custom-copy-text="\(**P0.01\)" ，span data-custom-copy-text="\(***P0.001\)" ）。

三、研究结果

1. HCC 中 BRD4 相关 DEGs 的鉴定与分析：研究人员分析了 TCGA 数据库中 HCC 与非癌肝组织的基因表达谱，鉴定出 3257 个 DEGs，其中 2879 个上调，378 个下调。通过查询 BIOGRID 数据库并与 DEGs 列表交集分析，得到 46 个 BRD4 相互作用的差异表达基因（BRD4-interacting Differentially Expressed Genes，BI-DEGs）。绘制热图展示其表达模式，分析染色体定位确定其基因组分布。PPI 网络分析发现 BI-DEGs 之间存在显著相互作用，尤其是 CDK1、CCNA2、KIF2C、AURKA 和 KIF20A 等基因。富集分析表明 BI-DEGs 参与癌症相关生物学过程，如细胞周期调控、肿瘤发生、免疫反应、DNA 修复和催化活性调节等。体细胞突变分析显示 MKI67 突变率最高，达到 3%，且这些基因存在频繁的拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）。
2. 利用 BI-DEGs 构建并验证 HCC 预后模型：通过单因素 Cox 回归筛选出候选生存相关基因，再经 LASSO 生存分析构建基于 4 个基因（EZH2、KIF20A、G6PD 和 KIF2C）的预后模型。这 4 个基因在肿瘤组织中显著上调，提示其可能在肿瘤进展中发挥作用。Kaplan-Meier 评估显示，这些基因高表达与不良预后相关。在 TCGA-LIHC 数据集中，根据风险评分中位数将患者分为高、低风险组，低风险组患者的总生存期（Overall Survival，OS）、无病生存期（Disease-Free Survival，DFS）、无进展生存期（Progression-Free Survival，PFS）和疾病特异性生存期（Disease-Specific Survival，DSS）均优于高风险组，对 OS 的预测尤为准确。在独立队列中验证了该模型的有效性，低风险患者预后更好。GSVA 分析表明，高风险组主要富集于细胞生长相关过程、DNA 修复和信号转导，低风险组与炎症、细胞通讯和免疫反应显著相关。
3. 免疫景观与临床结局的综合分析：研究发现 BRD4 与 4 个预后基因的表达与肿瘤分期（T 类别）和疾病进展相关，提示这些基因上调与肿瘤恶性程度增加有关。单因素和多因素 Cox 回归分析证实风险评分是 LIHC 患者的独立预后指标。构建包含饮酒情况和风险评分的列线图预测患者 1 年、3 年和 5 年总生存率，并通过校准曲线验证其准确性。免疫浸润分析显示，高、低风险组患者在静息肥大细胞、M0 巨噬细胞、活化 CD4 记忆 T 细胞和滤泡辅助 T 细胞浸润方面存在显著差异。预后基因与抗肿瘤免疫相关免疫细胞呈负相关，高风险组 TME 和 TIDE 评分更高，表明其免疫逃逸能力更强。此外，BRD4 与 4 个特征基因存在显著直接关联，提示这些基因可能通过抑制免疫反应促进肿瘤免疫逃逸。
4. 抗癌药物敏感性：基于 GDSC 数据库评估四基因风险评分与癌症药物反应的关系，发现高风险组对 SB216763、KRAS (G12C) inhibitor-12 和 PLX-4720 等药物敏感性增加，对 Crizotinib、GDC0810 和 MIRA-1 的敏感性降低 。
5. 验证实验：通过分析人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库的免疫组化图像，发现肿瘤组织中 BRD4、EZH2、KIF20A、G6PD 和 KIF2C 蛋白表达上调，Western blot 结果也证实了这一点。转录因子结合基序富集分析显示 EZH2 和 BRD4 之间存在大量共享转录因子网络，因此选择这两个蛋白进行后续实验。CCK8 检测结果表明，药物处理后 MHCC-97 H 和 HepG2 细胞的光密度（OD）值显著降低，细胞生长受到抑制，ZBC260 和 CPI-169 联合处理抑制效果最为明显。Annexin V/PI 双染流式细胞术检测显示，药物处理后凋亡细胞显著增多，联合处理组凋亡率最高，表明 ZBC260 和 CPI-169 具有协同促进细胞凋亡的作用。免疫印迹结果显示，药物处理降低了 BRD4 和 EZH2 蛋白表达，诱导 Bax 和 Bcl-2 表达变化，促进 caspase-3 活性，表明 BRD4 和 EZH2 在凋亡通路中起关键作用，药物通过靶向这两个蛋白影响下游蛋白表达，激活凋亡过程。

四、研究结论与讨论

本研究基于 TCGA-LIHC 数据集，鉴定出 46 个 BRD4 相互作用的 DEGs，这些基因可能在肿瘤增殖、耐药和侵袭中发挥重要作用。通过 LASSO 分析构建的包含 EZH2、KIF20A、G6PD 和 KIF2C 的四基因预后模型，在训练和验证队列中均表现出较高的准确性，列线图分析也证实了基于患者基因表达水平构建的风险评分的独立预后价值。

免疫浸润分析揭示了不同风险组之间的显著差异，高风险组中静息肥大细胞和调节性 T 细胞（Tregs）可能抑制免疫系统抗肿瘤能力，促进肿瘤逃逸，TIDE 评分分析也进一步证实了高风险组增强的免疫逃逸能力，这不仅验证了模型对预后的预测准确性，还强调了靶向特定免疫细胞增强抗肿瘤免疫的潜在价值。

在药物敏感性测试中，风险评分系统有助于识别对特定药物敏感或耐药的患者，为临床癌症治疗提供个性化指导。此外，转录因子结合位点分析发现 BRD4 和 EZH2 存在广泛共享位点，表明它们在基因表达调控中具有协同作用。实验证实，BRD4 抑制剂 ZBC260 和 EZH2 抑制剂 CPI-169 联合使用具有显著的协同效应，可有效抑制 HCC 细胞系增殖并诱导凋亡，通过调节凋亡相关蛋白表达，激活凋亡过程，为癌症治疗提供了一种有前景的策略。

本研究首次探索了 HCC 中 BRD4 和 EZH2 的联合抑制作用，并优化了药物剂量以降低潜在毒性，为 HCC 预后和临床治疗策略提供了新的见解，凸显了联合 BRD4 治疗在降低耐药性和增强治疗效果方面的优势。然而，研究也存在一定局限性，未来需要在更广泛的患者群体中验证四基因预后模型，并深入研究 BRD4 和 EZH2 与其他信号通路的相互作用机制。尽管本研究主要基于数据库和体外实验数据，但后续计划通过异种移植和类器官模型进一步验证研究结果，更准确地模拟患者反应，探索创新治疗策略。总体而言，该研究为 HCC 的诊疗开辟了新方向，有望推动肝癌治疗领域的发展，为提高患者生存率和生活质量带来新的希望。