抑制 SUMO 化显著增强糖皮质激素受体对急性淋巴细胞白血病细胞生长停滞的调控作用

为解决 B-ALL 治疗中糖皮质激素（GCs）耐药及副作用问题，芬兰东芬兰大学的研究人员开展 SUMO 化对 GR 作用影响的研究。结果发现抑制 SUMO 化可增强 GCs 对癌细胞生长抑制。这为提高 B-ALL 治疗效果提供新思路，值得科研人员阅读。

　　

芬兰东芬兰大学（University of Eastern Finland）的 Emma Valima 等人在《Oncogene》期刊上发表了题为 “SUMOylation inhibition potentiates the glucocorticoid receptor to program growth arrest of acute lymphoblastic leukemia cells” 的论文。该研究在急性淋巴细胞白血病（ALL，一种常见且侵袭性强的儿科癌症，其中多数为 B 细胞急性淋巴细胞白血病，即 B-ALL）治疗领域具有重要意义，为提高治疗效果、克服糖皮质激素（GCs）治疗局限性提供了新的思路和潜在策略。

研究背景

ALL 是儿童中最常见的癌症，其中 B-ALL 又占 ALL 病例的大多数。尽管近几十年来 B-ALL 的治疗取得了进展，但治疗方案仍不理想，约 15% 的成年患者对初始治疗耐药，15 - 20% 的患者会复发，复发患者的预后很差。

GCs，如地塞米松（Dex），是治疗 ALL 的一线联合化疗的主要药物。其治疗效果主要通过糖皮质激素受体（GR，一种核受体，作为配体激活的转录因子直接调节基因表达）介导，通常认为是通过诱导白血病细胞死亡来实现的。然而，GCs 存在疗效差异大、易产生耐药性以及副作用多（如肌病、骨病和易感染等）等问题。

SUMO 化（SUMOylation，即小泛素样修饰蛋白 SUMO 与靶蛋白的共价结合）作为一种蛋白质翻译后修饰，在多种癌症的治疗中展现出潜在的应用价值，在其他血液恶性肿瘤中已有研究表明其可作为治疗靶点。在癌症细胞中，SUMO2/3 水平通常较高。SUMO 化通过由 SUMO 激活酶（SAE1/2）、SUMO 结合酶（UBC9）和 SUMO 连接酶（如 PIAS1）等组成的动态级联反应进行，且可被 SUMO 特异性蛋白酶（SENPs）逆转。在 B-ALL 中，虽然 SUMO 化途径的相关成分已被发现与耐药 - 复发基因有关，但 SUMO 化在 B-ALL 中的具体作用尚未得到深入研究。因此，探究 SUMO 化如何影响 GR 在 B-ALL 中的作用显得尤为重要。

研究方法

1. 细胞培养与处理：使用人前 B 细胞系 NALM6、REH 和 697 细胞进行实验，将细胞培养在含有特定成分的培养基中，并分别用不同浓度的地塞米松（Dex）、SUMO 化抑制剂（SUMOi，ML-792）或两者的组合处理。
2. 细胞增殖与毒性检测：采用 CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 检测细胞增殖，使用 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit 检测细胞毒性，通过相应的统计方法分析数据。
3. 细胞周期与凋亡检测：利用 Phase Flow Alexa Fluor 647 BrdU Kit 进行细胞周期分析，用 APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD 检测细胞凋亡，通过流式细胞仪检测并分析数据。
4. 体内药物反应检测：提取儿科 B-ALL 患者样本中的单核细胞（MNCs），经处理后用 TAK-981（一种优化后的 SUMOi）、Dex 或两者组合处理，使用 CellTiter-Glo assay 检测细胞活力。
5. 免疫印迹：处理 NALM6 细胞后，提取蛋白进行免疫印迹，检测 SUMO2/3、GR 和 GAPDH 等蛋白的表达水平。
6. RNA 测序（RNA-seq）：处理 NALM6 细胞后提取 RNA 并进行 mRNA 分离，构建 RNA-seq 文库，对测序数据进行处理和分析，确定差异表达基因并进行通路分析。
7. 染色质可及性分析（ATAC-seq）：处理 NALM6 细胞后分离细胞核，进行转座反应和 PCR 扩增，构建 ATAC-seq 文库，对文库进行质量评估和测序，分析染色质可及性的变化。
8. 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）：处理 NALM6 细胞后进行染色质免疫沉淀，构建 ChIP-seq 文库，对测序数据进行分析，研究 GR 和 SUMO2/3 在染色质上的结合模式。
9. 染色质定向蛋白质组学（RIME）：采用 RIME 方法对 NALM6 细胞进行处理，通过免疫沉淀和质谱分析鉴定与 GR 和 SUMO2/3 相关的染色质蛋白，分析蛋白质相互作用网络。

研究结果

1. SUMO 化抑制增强糖皮质激素诱导 B-ALL 细胞周期停滞的能力：通过细胞增殖实验发现，Dex 和 SUMOi 均能剂量依赖性地抑制 NALM6 细胞增殖，两者联合使用效果更显著，且在另一种 GC 敏感的 B-ALL 细胞系 697 中也得到验证，但对 GC 耐药的 REH 细胞无效。免疫印迹结果显示，SUMOi 能有效降低细胞中 SUMO 化水平，且与 Dex 联合使用时对 GR 蛋白水平有一定影响。细胞周期分析表明，Dex 和 SUMOi 单独使用时均可使 S 期细胞减少，G0/G1 期细胞增加，两者联合使用对细胞周期的影响更为显著，使细胞明显停滞在 G0/G1 期。凋亡实验显示，SUMOi 和 Dex 联合使用对细胞凋亡无明显的协同作用，表明 SUMO 化抑制增强 Dex 增殖抑制作用主要是通过诱导细胞生长停滞而非增加凋亡。
2. SUMO 化抑制对患者 B-ALL 细胞活力的影响：使用 TAK-981 和 Dex 联合处理患者来源的 B-ALL 细胞，发现联合处理比单独使用 TAK-981 或 Dex 更能有效降低细胞活力，但不同患者对药物的反应差异较大，与 B-ALL 的遗传亚型无简单关联。
3. SUMO 化抑制对 GR 调控基因的影响：RNA-seq 分析表明，Dex 和 SUMOi 单独处理分别调节 545 和 411 个基因的表达，两者联合处理影响 1803 个基因的表达。进一步分析发现，Dex 和 SUMOi 联合处理对部分基因的表达调控具有协同作用，尤其是与细胞周期调控相关的基因。例如，在 Dex + SUMOi 下调的基因中，包含控制有丝分裂细胞周期 G1/S 转换、DNA 复制和有丝分裂核分裂的基因。
4. SUMO 化抑制增强 GR 结合染色质并修饰 Dex 对染色质可及性的影响：ChIP-seq 和 ATAC-seq 分析显示，SUMOi 显著降低了染色质上 SUMO2/3 的结合量，同时增强了 GR 在染色质上的结合，产生了新的 GR 结合位点（GRBs）。这些新的 GRBs 更倾向于定位在启动子 - TSS 区域，富含 ETS 家族转录因子（TF）的结合基序，而 GRE 基序较少。SUMO 化抑制还在一定程度上改变了染色质的可及性，但这种改变不能完全解释 GR 染色质结合增强和受体顺反子组重编程的现象。
5. GR 的染色质 - 蛋白质网络与 SUMO2/3 相互关联：通过 RIME - 基于的方法鉴定出与 GR 和 SUMO2/3 相关的染色质蛋白，发现 GR 相关的染色质蛋白大多也与 SUMO2/3 相关，表明 GR 的染色质伙伴主要是 SUMO 化的。Dex 处理可使许多蛋白质与 GR 的结合增强，这些蛋白质包括转录共调节因子和 B 细胞转录因子等。
6. B 细胞转录因子与 GR 共占据染色质：在 Dex 依赖的 GR 染色质蛋白组中发现了大量 B 细胞转录因子，如 EBF1、ELF1、ERG 等。通过比较转录因子结合基序和 GRBs 的信息，发现这些转录因子的结合基序与 GR 在染色质上的结合位点密切相关，表明 GR 和这些转录因子在染色质上紧密平行存在。
7. SUMO 化抑制减弱 GR 与其染色质伙伴的关联：SUMO 化抑制总体上降低了 GR 染色质蛋白组成员与 GR 的结合强度，许多转录因子和共调节因子在 SUMO 化抑制后与 GR 的结合减少或完全丧失，如 TCF3、PAX5 等。这表明 SUMO 化可能直接或间接调节这些蛋白质与 GR 和 / 或染色质的相互作用。

研究结论与讨论

该研究通过多组学方法和细胞模型实验，深入探讨了 SUMO 化与 GR 在 B-ALL 中的相互作用。研究结果表明，SUMO 化抑制与亚饱和 GC 治疗联合使用，能更有效地抑制 B-ALL 细胞增殖，主要是通过诱导细胞周期停滞而非增强凋亡途径，这提示了一种潜在的、更有利的治疗机制。

SUMO 化抑制显著增强了 GR 在染色质上的结合，导致基因表达谱改变，尤其是影响细胞周期调控相关基因。新发现的由 SUMO 化抑制诱导的 GRBs 具有独特的特征，其富集在启动子区域，缺乏 GRE 基序，但富含 ETS 基序。这些新的 GRBs 与细胞周期相关基因的下调有关，可能是 SUMO 化抑制增强 GC 诱导的生长停滞的重要原因。

染色质定向蛋白质组学揭示了 GR 在 B-ALL 细胞中的染色质蛋白网络，包括许多转录共调节因子和 B 细胞转录因子。这些转录因子与 GR 在染色质上的共占据，强调了它们在调节基因表达中的协同作用，可能决定了 GR 介导的转录调控在 B-ALL 细胞中的特异性和有效性。同时，研究还发现 SUMO 化在调节 GR 的基因组靶向、转录复合物的形成和稳定性方面发挥着重要作用。

综上所述，该研究为靶向 SUMO 化增强糖皮质激素在 ALL 治疗中的作用提供了有力证据，这种方法不仅可能减轻 GC 耐药性，降低治疗所需的 GC 剂量，还可能为其他使用 GC 治疗的癌症提供更具选择性和低毒性的治疗策略。不过，目前的研究主要在体外和体内实验中进行，未来还需要更多的体内研究来进一步验证这些发现的有效性和安全性，以推动其在临床治疗中的应用。