突破性进展！兔模型中自体组织扩张移植物用于阴道重建的功能评估及临床转化前景

为解决女性先天性或后天性阴道异常治疗难题，丹麦哥本哈根大学 Oliver Willacy 团队开展兔模型中 PLATE 移植物阴道重建研究。结果显示该移植物效果良好。此研究为阴道重建提供新思路，极具科研价值，推荐阅读。

　　

丹麦哥本哈根大学健康与医学科学学院附属医院（Rigshospitalet, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen）的 Oliver Willacy 等人在《npj Women's Health》期刊上发表了题为 “Functional assessment of autologous tissue expansion grafts for vaginal reconstruction in a rabbit model” 的论文。这篇论文在女性阴道重建手术的组织工程领域意义重大，为解决先天性或后天性阴道异常问题提供了新的方向与思路。

研究背景

人类阴道容易出现各种形态异常，其中一些先天性疾病，如 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser（MRKH）综合征，每年约每 5000 名新生女婴中就有 1 例，主要特征为生殖器官发育不全，包括阴道闭锁 。其他罕见的异常情况，像雄激素不敏感综合征、持续性泄殖腔或泄殖腔外翻等，也会导致不同程度的阴道闭锁或发育不全。此外，宫颈癌或邻近器官的放射治疗可能会产生长期副作用，造成继发性阴道结构缺陷。

对于阴道闭锁，传统的标准治疗方法通常是非侵入性的 Frank 扩张治疗，即通过逐渐增加扩张器的长度和直径插入阴道口的凹陷处。然而，这种方法在较严重的病例中可能效果不佳，这时就需要手术治疗。现有的手术方法，从半侵入性的牵引装置（如 Vecchietti 手术）到使用患者自身肠道、皮肤或口腔黏膜进行移植的复杂重建手术，都存在潜在的副作用，比如移植失败、瘘管形成、过多黏液分泌、剖腹手术并发症、疼痛、感染和疤痕形成等。这就凸显出开发具有更好生物相容性和更少副作用的替代移植技术的迫切需求。

在这样的背景下，组织工程技术成为了开发新疗法的有力工具。在过去二十年里，阴道组织工程领域蓬勃发展，各种创新策略不断涌现，涵盖了使用合成材料和生物支架的多种方法，并在体外和体内研究中接受检验。一项涉及 4 名 MRKH 综合征患者的临床试点研究表明，自体组织培养的小肠黏膜下层移植物具有长期功能，显示出这些方法从实验室走向临床应用的潜力。但即便近十年前就有了这些有前景的结果，这些技术仍未成为标准的临床治疗方案。这背后的原因复杂多样，既包括组织工程领域固有的科学挑战，也涉及成本、可及性和监管等方面的考量。传统的组织工程依赖于在 GMP 认证设施中进行的复杂多步骤培养过程，由于可及性有限，导致临床应用存在差距。因此，本研究引入了一种新兴的再生方法，旨在绕过这些资源密集型步骤，使先进的组织工程在临床环境中更具可行性。

研究方法

本研究采用了一种名为围手术期分层自体组织扩张（Perioperative Layered Autologous Tissue Expansion，PLATE）移植物的技术。该技术借鉴了 1958 年 Meek 提出的微移植原理，当时 Meek 证明了切碎的皮肤自体移植物可用于烧伤患者的皮肤扩张。研究团队在此基础上进行拓展，探索该技术在其他带有上皮的器官（如膀胱、食道、子宫和阴道）组织扩张中的新应用。

PLATE 移植物的制备过程如下：从切除的阴道组织中获取约 1cm2 的组织，将其上皮层和光滑肌肉层分离并切碎成 1.5mm2 的微移植物。把切碎的上皮微移植物放置在可生物降解的聚乙交酯 910（polyglactin 910，Vicryl?）网的一侧，肌肉微移植物放置在另一侧，然后将构建体嵌入 I 型胶原蛋白凝胶中。凝胶固化后，对构建体进行压缩，整个移植物可在 30 分钟内制备完成，用于手术植入。

研究中，28 只 17 - 19 周龄的雌性新西兰白兔参与实验。在手术中，从兔子腹侧阴道壁切除 20×30mm 的组织，留下背侧的原生阴道组织条。将制备好的 PLATE 移植物（n = 11）或无细胞移植物（acellular graft，n = 9）植入阴道缺损处，另外 8 只兔子进行假手术（sham laparotomy）作为对照组。实验过程中，对兔子进行不同时间点的观察和检测，包括术后 2 周的组织学和 mRNA 测序分析，术后 3 个月的 X 射线、阴道镜检查和活检，术后 6 个月进行交配和生育试验，术后 7 个月进行最终的组织学评估。

研究结果

1. 阴道重建和移植物制备：28 只兔子接受了剖腹手术，切除阴道组织并制备移植物。术后，10 只兔子在 2 周后安乐死进行组织学和转录组分析，其余 18 只兔子在 3 个月后进行 X 射线、阴道镜检查和活检，6 个月后进行交配和生育试验，7 个月后进行最终组织学评估。
2. 不良事件：两只动物未完成试验期，一只因术后第一天腹部软组织自伤（PLATE 移植物动物），另一只因手术后 80 天感染多器官的丝状梭菌（Tyzzer’s disease，无细胞移植物动物）。一只兔子在 2 周尸检时发现膀胱阴道瘘，可能是由于严重的膀胱钙化和不当放置的缝线穿透阴道和膀胱腔所致（PLATE 移植物动物），后续手术中已避免使用该缝线。此外，一只 PLATE 移植物动物在 3 个月阴道镜检查时发现解剖变异，导致其被排除在生育试验之外。
3. 宏观外观：术后 2 周，PLATE 移植物在宏观上与阴道壁良好整合，聚乙交酯网在半透明的胶原层后仍可见，管腔侧还能识别出一些切碎的组织颗粒。无细胞移植物的阴道外观与 PLATE 移植物相似，但没有切碎的颗粒。假手术对照组兔子的阴道内黏膜光滑，无缝合材料。术后 3 个月，腹部 X 射线和阴道镜检查显示，所有动物均无瘘管或功能性狭窄，阴道内可见蠕动收缩。术后 7 个月，PLATE 移植物中的聚乙交酯网、胶原和切碎的组织颗粒在宏观上已不可见，移植物区域与正常阴道外观相似，所有阴道管腔直径至少为 1.2cm，无狭窄或纤维化带。
4. 移植物发育的微观评估：术后 2 周，PLATE 移植物和无细胞移植物都有大量不同表型的无序细胞，PLATE 移植物中有切碎的肌肉组织颗粒，两组移植物的管腔表面都有新黏膜形成和术后炎症反应的迹象。术后 3 个月，从移植物区域（或对照阴道的类似解剖区域）采集的黏膜活检显示，所有活检组织的黏膜形态与对照阴道相似。术后 7 个月，PLATE 移植物区域的阴道壁厚度与正常阴道壁相似，而无细胞移植物区域的厚度明显比对照组薄；PLATE 移植物区域和无细胞移植物区域的长度和横截面积没有显著差异。
5. 基因表达：术后 2 周收集移植物相邻 10mm 处的活检组织进行 mRNA 测序。研究发现，无细胞组与对照组之间差异表达基因（DEGs）最多，PLATE 组与对照组之间次之，PLATE 组与无细胞组之间有 163 个 DEGs。在 PLATE 组与无细胞组的阴道壁活检中，41 个已知的平滑肌基因中有 7 个显著上调，其中差异最大的是编码平滑肌肌动蛋白 γ - 2 的 ACTG2 基因。通过 STRING 网络分析和功能富集，确定了 18 个 GO 术语，主要涉及细胞外基质（ECM）组织和肌肉相关的生物过程。
6. 长期移植物成分评估：术后 7 个月，通过 Masson 三色染色和全细胞角蛋白染色评估阴道组织。结果显示，PLATE 移植物有多个区域的平滑肌组织发育完全且组织良好；PLATE 移植物、无细胞移植物和正常阴道的细胞角蛋白相对浓度相似；PLATE 移植物中胶原蛋白与肌肉组织的比例明显低于无细胞移植物，与正常对照组相似；PLATE 移植物区域的平滑肌含量明显多于无细胞移植物区域，血管结构数量在 PLATE 移植物区域有高于无细胞移植物区域的趋势，但差异无统计学意义。
7. 阴道功能评估：术后 6 个月，每组随机选取 3 只兔子与雄性兔子交配。所有兔子在第一次交配周期内均怀孕，9 只兔子中有 8 只能够自然阴道分娩，且各组的产仔数、出生体重、死产率和 72 小时活仔存活率相似。一只 PLATE 移植物动物无法自然分娩，尸检发现是腹腔内的粘连阻碍了产道的正常活动。

研究结论与讨论

本研究在兔模型中对 PLATE 移植物用于阴道重建手术进行了临床前评估。结果表明，PLATE 移植物在短期、中期和长期内都表现出良好的组织整合性，其长期组织形态与天然阴道组织相似，在阴道厚度、黏膜衬里方面表现良好，并且有高度的平滑肌和结缔组织再生。更重要的是，经 PLATE 移植物重建的阴道功能与天然阴道相似，兔子能够成功受孕并自然分娩。

从基因表达分析来看，术后 2 周 PLATE 移植物中部分平滑肌基因的上调，可能是其后期肌肉含量增加的原因，这也表明微移植物在早期就可能诱导平滑肌再生。与传统组织工程方法相比，PLATE 移植物技术是一种围手术期的一次性操作，不需要复杂的前期组织培养步骤，技术投入相对较小，具有一定的优势。

然而，本研究也存在一些局限性。实验使用的是健康阴道组织的动物模型，对于患病模型中组织再生和阴道功能的进展情况尚不清楚，而且兔阴道与人类阴道在解剖和功能上存在差异，将研究结果转化到人类临床应用还面临挑战。此外，本研究没有探索阴道器官的所有主动力学特性，这可以在未来的研究中进一步探讨。

总体而言，这项研究证明了 PLATE 移植物为兔阴道重建手术提供了一种可行的单阶段方法，在传统方法效果不佳的情况下，为解决阴道畸形、儿科中空器官闭锁和妇科肿瘤等相关问题提供了新的思路，为自体组织扩张在中空器官重建中的应用奠定了概念验证基础。后续还需要进一步研究确定其在人类患者中的适用性，并优化方法以用于临床实践。