跨物种分析、孟德尔随机化与临床证据验证氨氯地平 ——ADHD 治疗的全新曙光

为解决 ADHD 现有治疗手段的局限，3Z 等单位的研究人员开展氨氯地平作为新型 ADHD 治疗药物的研究。结果发现其能改善动物 ADHD 相关行为，且在人类遗传数据中也有疗效。推荐阅读，助力探索 ADHD 治疗新方向。

　　

来自冰岛雷克雅未克 Menntavegur 1 的 3Z、德国波茨坦 biotx.ai GmbH 等多个单位的研究人员，在《Neuropsychopharmacology》期刊上发表了名为 “Validation of L-type calcium channel blocker amlodipine as a novel ADHD treatment through cross-species analysis, drugtarget Mendelian randomization, and clinical evidence from medical records” 的论文。这篇论文在注意力缺陷多动障碍（ADHD^{注 1} ）治疗研究领域意义重大，为开发新型 ADHD 治疗方法提供了全新的思路和方向。

研究背景

ADHD 是一种普遍存在的神经发育障碍，影响着全球 2 - 5% 的人口。患者症状通常在儿童早期出现，并持续到成年，会引发一系列行为和精神问题。若不加以治疗，ADHD 会导致功能受损，增加患情绪和焦虑障碍的风险，甚至可能引发自杀。目前，ADHD 的主要治疗方法是使用兴奋剂药物，如哌甲酯和右旋安非他明，但这些药物存在诸多副作用，如食欲减退、高血压、头痛和睡眠障碍等，还具有较高的滥用可能性。二线治疗药物不仅效果不如兴奋剂，且约 25% 的患者对现有治疗方法均无明显改善。因此，迫切需要开发更创新、有效的 ADHD 治疗方法。

此前，研究人员利用 adgrl3.1 斑马鱼突变模型，发现了五种有潜力重新用于 ADHD 治疗的化合物，包括醋氯芬酸、氨氯地平、多沙唑嗪、莫索尼定和 LNP599。本研究旨在通过人类遗传建模，评估这些化合物是否能进一步开发成为可行的 ADHD 治疗药物。研究人员首先要确定在斑马鱼中观察到的对多动表型的挽救作用是否也适用于哺乳动物系统，并将研究范围从多动扩展到冲动性。

研究方法

1. SHR 大鼠旷场实验：将 WKY 野生型和 SHR 大鼠随机分组，每组样本量根据先前研究确定，以达到 0.8 的功效和 0.05 的显著性水平。大鼠在适应环境两周后，分为七个 SHR 组和一个 WKY 对照组，分别接受不同处理，包括对照载体、可乐定、莫索尼定、多沙唑嗪、氨氯地平、醋氯芬酸、LNP599，处理 30 天。在给药前（D0）和第 29 天（D29）进行旷场实验，测试在光照阶段进行，实验前大鼠需在测试室适应 1 小时。通过红外光束记录大鼠在活动箱内 30 分钟内的行为，分析直立频率、移动距离和走动时间等指标。
2. adgrl3.1^-/-斑马鱼 5 - 选择连续反应时间任务（5 - CSRTT）：使用通过 CRISPR - Cas9 技术创建的纯合 adgrl3.1 敲除斑马鱼和年龄匹配的野生型对照鱼。鱼饲养在特定条件下，实验前通过配对繁殖并饲养至受精后四个月。实验时，adgrl3.1^-/-鱼在行为记录前分别浸入 10μM 氨氯地平或哌甲酯 30 分钟，对照组加入 DMSO。5 - CSRTT 用于训练斑马鱼对特定位置的光刺激做出反应，通过不同阶段的训练，评估鱼在实验中的冲动性，即量化鱼在刺激前间隔内抑制对光刺激反应的能力。药物处理采用伪平衡顺序，每周最多暴露于一种药物，实验数据通过 t 检验和线性混合效应模型分析。
3. 幼虫实验：对 adgrl3.1^-/-和年龄匹配的野生型斑马鱼幼虫进行多动和睡眠参数分析。评估 12 种不同的 L 型钙通道阻滞剂（LTCCBs^{注 2} ），每种药物在不同浓度下进行测试，与 0.3% DMSO 处理的幼虫对比，实验数据使用单向 ANOVA 和 Dunnett 多重比较事后分析。
4. 血脑屏障穿透实验：用 10μM 氨氯地平或载体处理成年 adgrl3.1^-/-斑马鱼 30 分钟，处理后冲洗、安乐死并提取大脑，使用特定仪器分析大脑中氨氯地平的含量。同时，对 Sprague - Dawley 大鼠进行单剂量或重复口服氨氯地平处理，收集血液和大脑样本，使用 LC - MS/MS 分析血浆和大脑中氨氯地平的浓度。
5. c - Fos 成像：将 adgrl3.1^-/-和野生型斑马鱼幼虫暴露于 10μM 氨氯地平或 0.1% DMSO 中 24 小时，进行免疫组织化学染色，使用共聚焦显微镜获取荧光图像，用 ImageJ Fiji 软件量化端脑中的 c - Fos 表达，实验数据通过单向 ANOVA 和 Tukey 多重比较检验分析。
6. 孟德尔随机化（MR^{注 3} ）：使用 FinnGen 提供的高血压汇总统计数据和 ADHD 的荟萃分析数据作为结果，140 个 GWAS^{注 4} 汇总统计数据作为暴露因素。对数据进行预处理，包括检查变异体、去除重复和多等位基因 SNP^{注 5} 等。通过设定 p 值阈值和进行连锁不平衡（LD^{注 6} ）聚类，确定有效工具变量，根据工具变量数量选择合适的 MR 方法进行分析。为考虑氨氯地平的多个药物靶点，从相关基因范围中选择变异体进行分析。
7. 多基因风险评分分析：基于欧洲人群的 ADHD GWAS 汇总统计数据，筛选英国生物银行（UK Biobank）中可用的遗传变异，应用 PRS - CS - auto 算法推断变异体的后验效应估计值，计算个体层面的 ADHD 多基因风险评分。对英国生物银行队列进行质量控制，排除不符合条件的个体。通过训练多个逻辑回归模型，评估 ADHD 风险评分与健康结果的关联，以及氨氯地平对情绪波动和冒险行为的影响。

研究结果

1. 氨氯地平影响 SHR 大鼠旷场行为：在 SHR 大鼠旷场实验中，长期每日给予氨氯地平（10mg/kg）可显著改变 SHR 大鼠的行为。与载体处理的 SHR 大鼠相比，氨氯地平处理的 SHR 大鼠在雌性组和合并性别组中，移动距离和走动时间均显著减少，但直立频率无显著差异。其他测试药物对 SHR 大鼠行为无显著影响，因此后续实验仅使用氨氯地平。
2. 氨氯地平减少成年 adgrl3.1 斑马鱼的冲动性：在 5 - CSRTT 实验中，adgrl3.1^-/-斑马鱼在基线时比野生型鱼表现出更多的过早反应。给予氨氯地平（10μM）和哌甲酯（10μM）后，adgrl3.1^-/-鱼的冲动反应均显著减少，表明氨氯地平能有效改善斑马鱼的冲动性，效果与哌甲酯相当。
3. 其他 L 型钙通道阻滞剂对幼虫 ADHD 模型多动和睡眠的影响：在幼虫 ADHD 实验中，12 种 LTCCBs 中有 7 种（西尼地平、非洛地平、伊拉地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平和维拉帕米）可显著降低幼虫的多动性，但除硝苯地平和尼莫地平外，其他药物在中高剂量时有毒性，且行为变异性高于氨氯地平。
4. 氨氯地平穿过血脑屏障并影响 c - Fos 表达：在斑马鱼和大鼠实验中，均证明氨氯地平能够穿过血脑屏障。在成年 adgrl3.1^-/-斑马鱼中，暴露于 10μM 氨氯地平后，大脑中可检测到氨氯地平。在 Sprague - Dawley 大鼠中，口服氨氯地平后，血浆和大脑中均有药物分布，且多次给药后药物浓度增加。此外，氨氯地平处理可显著下调 adgrl3.1^-/-和野生型斑马鱼幼虫端脑中的 c - Fos 表达。
5. 全基因组孟德尔随机化分析高血压和 ADHD：通过全基因组 MR 分析，确定了三个与高血压显著相关的性状（BMI^{注 7} 、苯丙氨酸和有核红细胞百分比）和三个与 ADHD 显著相关的性状（尿钠、较高的 BMI 和乙酸盐）。
6. 药物靶点孟德尔随机化证实氨氯地平治疗 ADHD 症状的潜力：药物靶点 MR 实验表明，编码 L 型钙通道三个测试亚基（α1 - C、β1、α2δ3 ）的基因变异以及所有氨氯地平靶基因的组合，均能遗传预测对 ADHD 的显著影响，而其他相关基因变异则无此效果。这一结果支持了氨氯地平通过作用于 L 型钙通道影响 ADHD 的假设。
7. 氨氯地平与英国生物银行中自我报告的 ADHD 症状降低相关：在英国生物银行中，由于 ADHD 诊断率较低，无法直接评估氨氯地平处方对该疾病的影响。通过构建多基因风险评分，研究发现氨氯地平状态是情绪波动和冒险行为的显著预测因子。在考虑 ADHD 风险的情况下，服用氨氯地平的个体报告情绪波动或冒险倾向的可能性显著降低，且这种效果不能由降压药雷米普利（一种 ACE^{注 8} 抑制剂）产生，表明氨氯地平在缓解 ADHD 症状方面具有独特功效。

研究结论与讨论

本研究通过多种实验方法，在斑马鱼、大鼠和人类遗传数据中进行研究，表明氨氯地平在减少 ADHD 相关行为方面具有显著效果。在动物模型中，氨氯地平既能降低斑马鱼的多动和冲动性，又能减少大鼠的多动行为。在人类遗传研究中，孟德尔随机化分析支持了氨氯地平靶基因变异与 ADHD 之间的潜在因果关系，且在英国生物银行数据中，氨氯地平与自我报告的 ADHD 相关症状减少有关。

氨氯地平具有重新用于 ADHD 治疗的潜力，其安全性良好，药物相互作用风险低，已获得 FDA 批准，且作为仿制药价格实惠。此外，氨氯地平作用于 L 型钙通道，影响神经元放电模式、转录调节和神经递质释放，还具有神经保护作用，可能从多个方面影响 ADHD 的神经生物学机制。

然而，本研究也存在一定局限性。例如，MR 分析虽能推断因果关系，但遗传变异的效应与药物实际效果可能存在差异，且无法预测药物的潜在不良反应。此外，动物模型与人类的差异以及研究中样本量的限制等，都可能影响研究结果的普遍性和准确性。尽管如此，本研究首次通过药物靶点 MR 研究，利用多个药物靶基因的工具变量，验证了氨氯地平对 ADHD 的治疗效果，为开发新型 ADHD 治疗方法提供了重要依据，有望推动 ADHD 治疗领域的进一步发展。未来研究可进一步优化氨氯地平的治疗方案，探索其在不同人群中的疗效差异，为 ADHD 患者带来更有效的治疗选择。

注 1：ADHD，Attention - Deficit/Hyperactivity Disorder，注意力缺陷多动障碍。
注 2：LTCCBs，L - type calcium channel blockers，L 型钙通道阻滞剂。
注 3：MR，Mendelian Randomization，孟德尔随机化。
注 4：GWAS，Genome - Wide Association Study，全基因组关联研究。
注 5：SNP，Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性。
注 6：LD，Linkage Disequilibrium，连锁不平衡。
注 7：BMI，Body Mass Index，身体质量指数。
注 8：ACE，Angiotensin - Converting Enzyme，血管紧张素转换酶。