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为解决寻找天然可持续 P4 来源及探究核桃 P4 遗传机制问题，INRAE 的研究人员开展核桃叶 P4 含量遗传架构的 GWAS 研究。发现多个相关位点和候选基因，这对核桃育种及 P4 资源开发意义重大，值得科研人员一读。
法国国家农业、食品与环境研究院（INRAE）的 Anthony Bernard 等人在《BMC Genomics》期刊上发表了题为 “Genome-wide association study dissects the genetic architecture of progesterone content in Persian walnut leaves (Juglans regia L.)” 的论文。这篇论文在植物激素研究以及植物资源开发利用领域具有重要意义，为挖掘核桃作为天然孕酮来源的潜力提供了关键的理论依据，有望推动农业和医药行业的可持续发展。
研究背景
在动物生产中，激素调控对羊和山羊的繁殖周期至关重要，传统上使用孕酮（Progesterone，P4）或合成孕激素来同步或诱导发情，从而实现人工授精和遗传改良。然而，这些激素处理方式正逐渐被农民摒弃，因为它们会释放到水环境中造成污染，并且在有机农场中被禁止使用，这限制了有机养殖系统中的遗传改良潜力。
在人类健康领域，P4 被广泛用于缓解经期疼痛和管理更年期症状，同时还能降低更年期激素治疗期间患乳腺癌的风险。目前，所有 P4 产品均来自化学合成，虽然有从植物中提取的薯蓣皂苷元合成的 P4 作为天然替代品的说法，但人们越来越希望找到更可持续、基于植物的 P4 来源，以满足公众对健康和环境的关注。
值得注意的是，越来越多的研究发现植物中存在哺乳动物激素，核桃树叶就是一个典型例子，其 P4 含量较高，且在北半球 10 月树叶衰老前达到峰值。此前，在核桃研究中，全基因组关联研究（Genome-wide association study，GWAS）已成功确定了开花日期、果实重量等数量性状的遗传基础。鉴于核桃树叶中高含量的 P4，研究人员开展此项研究，旨在探究核桃中 P4 含量的遗传决定因素，为将核桃作为可持续的、基于植物的 P4 来源用于兽医和人类应用奠定基础。
研究方法
- 植物材料与孕酮定量：研究选用了法国国家农业、食品与环境研究院李属 - 核桃生物资源中心收集的 170 份核桃（Juglans regia L.）种质资源，还纳入了 7 份野生近缘核桃物种（J. mollis、J. nigra 和 J. major）用于 P4 含量测定。2021 年 10 月 6 日至 7 日，从成年果树采集叶片，在低于 30°C 的温度下风干后储存。通过一系列步骤进行 P4 含量测定，包括叶片研磨、乙醇提取、离心、蒸发、重溶等，最终采用酶免疫分析（Enzyme immunoassay，EIA）法测定 P4 浓度，该方法灵敏度为 0.25mg/kg，批间变异系数小于 5.8%。2023 年，研究人员再次采样，对 6 个 P4 含量有差异的品种进行验证，测试 “年份”“位置”“地点” 对 P4 含量的影响，同时还收集了 2 个新的裂叶核桃品种。
- 全基因组关联分析、连锁不平衡（LD）区块与注释搜索：使用 R 包 “tidyverse” 进行数据管理和可视化。对每个品种进行两次 P4 定量（技术重复），取平均值作为表型数据。利用 Axiom J. regia 700K SNP 芯片对样本进行基因分型，并进行质量控制，最终保留 364,275 个稳健的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）用于全基因组分析。使用 R 包 “GAPIT version 3” 进行 GWAS 分析，测试了三种多基因座模型：多基因座混合模型（Multi-Locus Mixed Model，MLMM）、固定和随机模型循环概率统一方法（Fixed and random model Circulating Probability Unification method，FarmCPU）和 BLINK 模型。利用 HaploView v4.2 软件中的 “solid spine of LD” 方法研究标记 - 性状关联周围的 LD 区块，并在定义的 LD 区块内搜索候选基因。
- P4 含量与其他性状的相关性分析：研究人员利用 2018 年对核桃核心种质的 8 个物候性状和 25 个果实品质及营养成分性状的表型数据，以及 2023 年 6 月和 8 月对 170 份种质叶片疾病的表型数据，使用 R 包 “corrplot” 和 “PerformanceAnalytics” 进行 Pearson 相关性分析，探究这些性状与 2021 年测定的 P4 含量之间的相关性。
研究结果
- P4 定量与异常表型的年际含量：2021 年，在法国国家农业、食品与环境研究院的核桃种质资源中，P4 含量呈现出巨大差异，从中国品种‘Lu Guang’的 34.1μg/g 到‘Lacinié Suisse’的 287.5μg/g 不等。其中，两个裂叶核桃品种‘Laciniata’和‘Lacinié Suisse’的 P4 含量最高，它们的叶片呈裂叶状，主要用于观赏。与核桃相比，野生近缘核桃物种的 P4 含量极低。2023 年对 6 个对比品种的重新采样显示，P4 含量在年际间没有显著差异；在树的不同位置和不同地点采样，P4 含量也没有显著差异，但在树底部和 Toulenne 地点采样有获得更高 P4 含量的趋势。对于裂叶核桃品种，2021 年采样的两个品种在 2023 年仍保持较高的 P4 含量，而 2023 年新采集的两个品种 P4 含量较低。
- GWAS 的混杂因素与标记 - 性状关联：群体结构和亲属关系是 GWAS 中的常见混杂因素。在本研究的核桃种质资源中，根据起源可分为东欧和亚洲、西欧和美洲两个主要群体，群体结构对 P4 含量有显著影响，但通过贝叶斯信息准则（Bayesian Information Criterion，BIC）确定在 GWAS 模型中纳入的主成分数为零，即利用亲属关系矩阵来解释群体结构。通过 1% 的 Bonferroni 校正，研究共鉴定出 7 个与 P4 含量相关的标记 - 性状关联。不同模型和主成分数下，在不同染色体上检测到这些关联，如染色体 2 上的关联被多次检测到，可视为主要位点。不同关联的 SNP 解释的 P4 含量变异程度不同，且多数关联的等位基因具有加性效应。剔除两个裂叶核桃品种后进行 GWAS 分析，结果显示染色体 2 上的主要关联仍然存在，部分次要位点有所变化。
- LD 区块与候选基因：利用 “solid spine of LD” 方法发现，不同标记 - 性状关联周围的 LD 水平存在差异。例如，染色体 1 和 2 上两个关联的 SNP 分别属于小于 1kb 和 3kb 的 LD 区块，而染色体 15 上关联的 SNP 对应的 LD 区块则超过 100kb。在短 LD 区块内，如染色体 1 和 2 上的关联区域，未发现相关基因。在染色体 6 上的关联位于编码 “sterol 3-beta-glucosyltransferase UGT80B1” 的基因内，该酶在维持甾醇平衡中起重要作用，而甾醇是类固醇激素生物合成的重要前体。此外，研究还鉴定出 23 个在功能注释中包含 “steroid” 关键词的基因，但它们与 GWAS 峰值的距离均大于 1Mb。
- P4 含量与其他性状的相关性：通过对 2018 年的物候性状、果实品质性状以及 2023 年叶片疾病性状与 2021 年 P4 含量的相关性分析，结果表明 P4 含量与这些性状均无相关性。这意味着 P4 在核桃的物候事件、果实特征以及叶片疾病方面似乎没有直接关联。
研究结论与讨论
研究发现，法国国家农业、食品与环境研究院核桃种质资源中部分 J. regia 树新鲜叶片的 P4 含量较高，且该含量在年际间稳定，与裂叶叶片无关，也与其他性状无相关性。研究通过 GWAS 分析，在核桃 16 条染色体中的 7 条上鉴定出与 P4 含量变化相关的显著关联。其中，染色体 2 上的关联位点较为可靠，但该区域未发现候选基因，可能涉及基因调控机制或远程相互作用。染色体 6 上编码 “sterol 3-beta-glucosyltransferase UGT80B1” 的基因是一个有潜力的候选基因，其在维持甾醇平衡方面的作用可能间接影响 P4 的生物合成。
此外，核桃基因组中存在类固醇膜受体基因，而不存在类固醇核受体基因，这对于理解 P4 在植物生理学中的作用至关重要。这些研究结果对全球核桃育种计划具有重要意义，通过标记辅助选择策略，有望培育出既高产又富含 P4 的核桃新品种，为制药和营养保健行业提供可持续的 P4 来源，同时提高核桃果园的经济价值，优化土地利用效率。在气候变化限制核桃产量的背景下，这一研究成果有助于法国等地区的核桃生产者提升果园价值。
展望未来，对已鉴定候选基因的瞬时转化、核桃叶片中 P4 前体和 P4 膜受体的定量分析等研究，将有助于更深入地了解该基因在核桃类固醇代谢中的功能作用，进一步挖掘核桃作为天然 P4 来源的潜力，推动相关领域的发展。
