首次精准鉴定睑板腺干细胞群并揭示衰老机制，为眼健康研究开辟新方向

为解决睑板腺干细胞特性及衰老机制不明等问题，纽约西奈山伊坎医学院的研究人员开展相关研究。他们鉴定出睑板腺干细胞群，揭示 Hh 信号等机制。该成果为睑板腺相关疾病治疗提供新思路，值得科研人员一读。

　　

纽约西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）的研究人员 Xuming Zhu、Mingang Xu 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Identification of Meibomian gland stem cell populations and mechanisms of aging” 的论文。这项研究在睑板腺（Meibomian glands，MGs）相关领域意义重大，为深入理解睑板腺干细胞的特性、衰老机制以及相关疾病的治疗提供了关键依据，有望为睑板腺功能障碍和蒸发过强型干眼等疾病带来新的治疗思路 。

睑板腺是位于眼睑内的特殊全浆分泌皮脂腺，其分泌的富含脂质的睑脂（meibum）能防止泪膜蒸发，保护眼表。在衰老过程中，人和小鼠的睑板腺会出现萎缩，表现为大小减小和腺泡数量减少。睑板腺萎缩与蒸发过强型干眼疾病密切相关，这种疾病在老年人群中较为常见，严重时可导致视力丧失，然而目前却缺乏有效的治疗方法。

此前，虽然有研究提出多种可能导致睑板腺功能障碍的机制，如导管过度角化、免疫细胞浸润和腺泡基底细胞增殖减少等，但睑板腺干细胞的身份、其微环境的本质以及在体内控制其功能的机制仍不明确。相比之下，对毛囊相关皮脂腺干细胞的研究较为深入，而睑板腺干细胞的特异性标记物尚未确定。同时，干细胞活动受多种细胞间信号通路调控，虽然已知 Hedgehog（Hh）通路在皮脂腺发育和干细胞活动调节中起重要作用，且在睑板腺中有表达，但 Hh 通路是否在体内调节成年睑板腺的稳态和干细胞活性尚不明确。基于以上种种未知，开展这项研究显得尤为必要，旨在揭示睑板腺干细胞的奥秘，为相关疾病的治疗找到新方向。

在这项研究中，研究人员运用了多种先进的关键技术方法。首先是单细胞核 RNA 测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq），由于富含脂质的分化睑板腺腺泡细胞脆弱，难以通过离心收集，而 snRNA-seq 可以通过分离细胞核，捕获包括分化的睑板腺细胞在内的所有睑板腺细胞，从而揭示成年小鼠睑板腺的细胞异质性以及衰老过程中睑板腺上皮细胞和周围组织微环境的变化。其次是体内谱系追踪（in vivo lineage tracing），通过构建特定的小鼠模型，如使用携带报告基因的 Lrig1-CreERT2、Lgr6-CreERT2 等小鼠，来研究表达特定标记物的细胞对睑板腺稳态的贡献。还有体外实时成像（ex vivo live imaging），对培养的睑板腺组织进行实时观察，直观地了解细胞的行为。此外，还运用了基因编辑技术，如构建 KRT14-CreERT2 Smofl/fl 等基因敲除小鼠模型和 Krt5-rtTA tetO-GLI2ΔN 等转基因小鼠模型，以研究相关基因和信号通路在睑板腺发育和稳态维持中的功能。

下面来看具体的研究结果：

1. snRNA-seq 识别多种不同的睑板腺上皮细胞群体：研究人员对 8 周龄和 21 月龄雄性小鼠的睑板进行 snRNA-seq 分析，通过 UMAP 分析鉴定出 34 个睑板细胞群体，并基于已知标记基因对各细胞群体进行注释，包括睑板腺导管基底细胞、导管上层基底细胞、开口细胞、腺泡基底细胞、导管细胞、分化中的睑板腺细胞和分化的睑板腺细胞等。同时，利用空间转录组分析验证了注释的准确性，发现睑板腺细胞群体的注释与其在睑板中的解剖位置相符。此外，通过 Velocity 和伪时间分析预测了睑板腺细胞群体的分化轨迹，还发现导管细胞可能对导管和腺泡基底细胞群体都有贡献，提示导管可能含有不同命运的干细胞或双潜能干细胞。
2. 睑板腺腺泡基底细胞和导管细胞表达毛囊和皮脂腺干细胞标记物：研究人员对已知的皮脂腺干细胞标记物进行分析，发现腺泡基底细胞表达 Lgr6、Slc1a3、Lrig1、Axin2 和 Gli2 等标记物，导管细胞表达 Gli2、Lrig1 等标记物。通过 RNAscope 验证了这些标记物在睑板腺中的表达，表明这些标记物可能也标记睑板腺内的干细胞。
3. 表达 Lrig1、Lgr6、Axin2、Slc1a3 和 Gli2 的细胞有助于睑板腺的稳态维持：研究人员通过体内谱系追踪实验，利用携带不同 CreERT2 和报告基因的小鼠模型，发现 Lrig1、Lgr6、Axin2、Gli2 和 Slc1a3 标记的细胞群体中含有自我更新的干细胞，这些干细胞在睑板腺细胞更新过程中持续存在，并产生分化的子代细胞，维持睑板腺导管和腺泡的稳态。其中，Gli2 表达的导管细胞后代还可出现在中央导管，进一步支持了导管细胞对不同睑板腺结构有贡献的结论。
4. Lrig1?干细胞位于睑板腺导管，向腺泡迁移：结合谱系追踪和体外实时成像技术，研究人员发现 Lrig1-CreERT2 Rosa26nTnG 小鼠在谱系追踪 40 天后，GFP?细胞克隆存在于睑板腺腺泡、导管和中央导管中。体外培养睑板组织并进行时间推移成像，观察到导管内的 Lrig1?细胞或其分裂产生的子代细胞向腺泡迁移并定居在腺泡基底层，表明 Lrig1?细胞可对腺泡基底层有贡献。
5. Hh 信号维持睑板腺稳态：研究人员通过对 snRNA-seq 数据集的分析和 RNAscope 验证，发现多种 Hh 通路成分在睑板腺中表达。通过构建 KRT14-CreERT2 Smofl/fl Rosa26mTmG 小鼠模型，诱导性敲除 Hh 共受体 Smo，结果显示 Smo 缺失的睑板腺腺泡变小，腺泡和导管基底细胞增殖显著减少，表明 Hh 信号促进腺泡和导管基底细胞的增殖，对成年睑板腺稳态至关重要。
6. 睑板腺上皮中 Hh 信号的过度激活导致腺泡和导管基底细胞的扩张：构建 Krt5-rtTA tetO-GLI2ΔN 转基因小鼠模型，使激活形式的 GLI2（GLI2ΔN）在睑板腺基底上皮细胞中表达，结果发现 GLI2ΔN?腺泡基底细胞在诱导后 2 天出现并开始扩张，7 天后大部分睑板腺细胞被替代，且腺泡和导管基底细胞增殖频率显著增加。同时，通过构建 KRT14-CreERT2 Ptch1fl/fl 小鼠模型，诱导性敲除内源性 Ptch1，也得到类似结果，表明 Hh 信号的过度激活会导致基底细胞扩张。
7. GLI2ΔN 促进 Lrig1 和 Lgr6 表达细胞的增殖，以牺牲分化为代价：对激光捕获的对照小鼠和 GLI2ΔN 小鼠的睑板腺进行批量 RNA-seq 分析，基因本体（GO）富集分析显示，GLI2ΔN 表达的睑板腺中上调的基因主要与细胞增殖调控有关，下调的基因与脂质代谢和睑板腺细胞分化相关。RNAscope 和免疫荧光分析进一步证实了相关基因表达的变化，且发现表达 Lrig1 和 Lgr6 的细胞群体在 GLI2ΔN 表达时扩张，表明 GLI2ΔN 促进增殖的同时抑制了睑板腺细胞的分化。
8. 表达 Lrig1、Lrg6 和 Axin2 的睑板腺干细胞促成了 GLI2ΔN 驱动的睑板腺过度生长：在携带 Gli2ΔN 的 Lrig1-CreERT2 Rosa26mTmG、Lgr6-CreERT2 Rosa26mTmG 和 Axin2-CreERT2 Rosa26mTmG 小鼠中进行谱系追踪，发现诱导 GLI2ΔN 表达后，GFP?/GLI2ΔN?细胞在腺泡基底层出现并在 10 天后克隆扩张，表明表达 Lrig1、Lgr6 和 Axin2 的睑板腺干细胞对 GLI2ΔN 引起的基底细胞扩张有贡献。
9. GLI2 在人类睑板腺癌中广泛表达，且表达 LRIG1 和 LGR6 的未分化细胞扩增：分析 7 例对照睑板腺和 10 例睑板腺癌（MGC）样本，发现 MGC 样本结构紊乱，KRT14 表达下调，GLI2、GLI1、LRIG1 和 LGR6 在 MGC 样本中广泛且高表达，增殖细胞广泛存在，而分化标记物 PLIN2 表达缺失，表明人类 MGC 的特征是表达睑板腺干细胞标记物的未分化和增殖性肿瘤细胞的扩增。
10. 衰老的睑板腺中表达 Hh 通路基因的细胞减少：研究人员发现衰老（21 月龄）的睑板腺与年轻（8 周龄）的相比，PPARγ 的细胞内分布改变，KRT5?腺泡基底细胞中增殖标记物 Ki-67 的阳性百分比显著降低。通过 CellChat 分析 snRNA-seq 数据，发现衰老小鼠中 Hh 通路基因表达水平降低，RNAscope 验证显示衰老睑板腺中表达 Ptch1 和 Gli2 mRNA 的细胞减少，但 Lrig1、Lgr6、Slc1a3 和 Axin2 等干细胞标记物的表达在衰老和年轻睑板腺中无明显差异。
11. 衰老的睑板腺中 GLI2 与乙酰化赖氨酸的结合增加：尽管衰老睑板腺中 Hh 通路活性降低，但 Hh 配体表达维持不变。通过邻近连接分析（PLA）发现，衰老睑板腺和周围基质中仍表达 GLI2 蛋白的细胞亚群中，GLI2 与乙酰化赖氨酸的结合增加，而乙酰化会减弱 GLI2 的转录活性。构建 Krt5-rtTA tetO-Cre Hdac1fl/fl Hdac2fl/fl 小鼠模型，诱导 Hdac1/2 缺失，发现腺泡基底和分化细胞中 GLI2 与乙酰化赖氨酸的结合增加，Ptch1 表达减弱，表明衰老睑板腺中 Hh 信号降低部分是由于 GLI2 乙酰化增加，影响其转录活性。
12. HBEGF 信号减少与睑板腺衰老相关：CellChat 分析预测 EGF 通路在睑板腺细胞间通讯中起作用，且在衰老小鼠中减弱，特别是 HBEGF-EGFR 介导的真皮细胞与导管和腺泡基底细胞之间的信号转导在衰老睑板腺中消失。通过 RNAscope 和免疫组化分析验证，发现衰老睑板腺中表达 Hbegf 的细胞减少，p-ERK1/2 水平降低，表明 HBEGF-EGFR 轴对睑板腺稳态很重要，其活性降低导致衰老睑板腺中腺泡基底细胞增殖减少。
13. 衰老破坏睑板腺微环境：对年轻和衰老睑板腺的 snRNA-seq 数据进行 GO 分析，发现衰老睑板腺腺泡基底细胞和周围真皮细胞中神经导向基因表达降低，RNAscope 验证了这一结果，且免疫荧光显示衰老小鼠睑板腺腺泡基底细胞附近神经密度降低。同时，衰老眼睑真皮成纤维细胞中胶原合成和细胞外基质组装相关基因表达下调，而衰老睑板腺腺泡基底细胞和导管细胞中与氧化和其他形式应激相关的基因上调，真皮细胞中与炎症相关的基因上调，表明睑板腺衰老与多种机制相关，包括 Hh 和 EGF 信号减少、外周神经功能改变、真皮微环境破坏和炎症。

综合研究结论和讨论部分，研究人员成功鉴定出维持睑板腺导管和腺泡不同区域的干细胞群体的标记物，为深入研究睑板腺干细胞提供了重要线索；明确了导管含有维持导管和腺泡结构的干细胞，丰富了对睑板腺组织维持机制的认识；揭示了 Hh 信号在睑板腺干细胞增殖中的关键作用，为理解睑板腺发育和稳态维持提供了重要理论依据。此外，发现衰老的睑板腺中 Hh 和 EGF 信号减少，为开发促进衰老睑板腺增殖的治疗方法提供了潜在靶点；还发现睑板腺衰老过程中基质微环境的关键改变，包括胶原表达和神经密度的变化，进一步加深了对睑板腺衰老机制的理解。

这些发现为睑板腺相关疾病的治疗开辟了新途径。例如，对于蒸发过强型干眼疾病，通过短暂、局部和严格控制地激活 Hh 和 EGFR 通路，刺激干细胞活性，有望改善睑板腺功能；对于睑板腺癌，抑制 Hh 通路，如使用 SMO 抑制剂，可能成为一种有效的治疗策略。然而，研究也存在一定局限性，如 snRNA-seq、空间转录组学和衰老相关实验仅在雄性小鼠中进行，可能遗漏了性别特异性差异。未来的研究可以进一步探讨这些差异，以及深入研究 HBEGF-EGFR 信号及其与 Hh 信号的相互作用机制，为睑板腺相关疾病的治疗提供更精准、更有效的方案。