靶向 TRA2β 毒性外显子：反义寡核苷酸介导的癌症治疗新突破

为解决癌症治疗难题，杰克逊基因组医学实验室研究人员开展 TRA2β - PE 相关研究。他们发现靶向 TRA2β - PE 的 ASO 能抑制癌细胞生长。这为癌症治疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

美国康涅狄格州法明顿市的杰克逊基因组医学实验室（The Jackson Laboratory for Genomic Medicine）的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Antisense oligonucleotide-mediated TRA2β poison exon inclusion induces the expression of a lncRNA with anti-tumor effects” 的论文。这篇论文在癌症治疗研究领域意义重大，为开发新型癌症治疗策略提供了关键的理论依据和实践方向，有望为攻克癌症带来新的曙光。

研究概述

该研究聚焦于致癌剪接因子 TRA2β（transformer 2 beta，一种参与 RNA 剪接调控的蛋白质），发现其在多种肿瘤中表达上调，且低 TRA2β-PE（poison exon，毒性外显子，可导致 mRNA 降解）包含率与患者生存率降低相关。研究人员通过一系列实验，利用反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）促进 TRA2β-PE 的包含，不仅降低了 TRA2β 蛋白水平，还诱导了具有抗肿瘤作用的长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的表达，在多种肿瘤细胞系、3D 细胞培养模型和体内小鼠异种移植癌症模型中展现出良好的治疗效果。

研究背景

RNA 可变剪接（Alternative RNA splicing，AS）是产生转录组多样性的关键机制，它能使一个基因编码多种功能不同的 RNA 异构体（isoforms），而这一过程由剪接因子（splicing factors，SFs）精确调控。在人类癌症中，异常的 AS 模式普遍存在，严重影响癌症的关键特征，其背后是 SFs 的改变，包括基因的突变和水平的失调。TRA2β 作为一种致癌剪接因子，在多种肿瘤（如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等）中表达上调，与肿瘤的侵袭性和患者生存率密切相关。它通过对下游靶基因的剪接调控，影响细胞信号传导、增殖、基因组完整性和细胞死亡等过程。然而，目前尚无针对 TRA2β 的分子治疗方法，因此，深入了解 TRA2β 的调控机制，对于开发新的肿瘤治疗策略至关重要。

TRA2β 的表达调控较为复杂，其前体 mRNA 包含一个超保守的非编码 “毒性外显子” TRA2β-PE。正常情况下，TRA2β 蛋白水平较高时，会负反馈促进 TRA2β-PE 的包含，而 TRA2β-PE 的包含会在成熟 mRNA 中引入提前终止密码子（premature termination codon，PTC），导致转录本被降解，从而调控 TRA2β 蛋白的表达。在肿瘤中，TRA2β 蛋白上调部分原因是 TRA2β-PE 的跳过增加，致使 TRA2β 蛋白表达失控，肿瘤细胞增殖和侵袭能力增强。此前研究发现，用 ASO 强制包含 TRA2β-PE 可降低乳腺癌细胞中 TRA2β 蛋白表达，抑制细胞增殖并诱导凋亡，但在其他癌症类型和临床前模型系统中的疗效和机制尚不清楚。

研究方法

1. 细胞系实验：研究人员选取了代表十种不同肿瘤类型的癌细胞系，用靶向 TRA2β-PE 的 ASO - 1570 和非靶向对照 ASO - CTL 转染细胞。运用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT - qPCR）和半定量 RT - PCR 检测 TRA2β-PE 的包含情况；通过蛋白质免疫印迹（western blotting）测定 TRA2β 蛋白水平；利用 caspase - 3/7 敏感荧光染料和高内涵成像检测细胞死亡；采用 EdU 掺入和高内涵成像评估细胞增殖。
2. RNA 测序（RNA - seq）：对 U87MG 和 MDA - MB231 细胞系进行 RNA - seq 分析，这些细胞系对 ASO - 1570 治疗有明显表型响应。通过 RNA - seq 检测基因表达和 AS 事件的变化，确定 ASO - 1570 对转录组的影响。
3. 基因编辑技术：使用 CRISPR/Cas9 技术构建缺乏 ASO - 1570 结合位点的 U87MG 和 MDA - MB231 细胞系，以及 TRA2β 基因敲除（knockout，KO）的细胞系，以明确 ASO - 1570 作用的机制，判断其细胞表型是否由脱靶效应引起。
4. RNA 荧光原位杂交（RNA - Fluorescent in situ hybridization，RNA - FISH）和细胞分级分离：运用 RNA - FISH 和细胞分级分离技术，研究 TRA2β-PE 包含转录本在细胞内的定位，探索其潜在功能。
5. 蛋白质组学分析：通过生物素标记的 RNA 下拉实验结合质谱（mass spectrometry）技术，鉴定与 TRA2β-PE 相互作用的蛋白质，确定其在细胞核内的结合蛋白和潜在功能。
6. 体内实验：建立患者来源的异种移植（patient - derived xenograft，PDX）小鼠模型，将人三阴性乳腺癌 TM00096 的肿瘤片段植入免疫缺陷小鼠体内，待肿瘤生长到一定体积后，进行瘤内注射 ASO - 1570、ASO - CTL 或 PBS，观察肿瘤生长情况，评估 ASO - 1570 在体内的疗效。

研究结果

1. 低 TRA2β-PE 包含与患者生存率负相关：研究人员利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的 RNA - seq 数据，对 30 种肿瘤类型中 TRA2β-PE 的剪接进行量化分析。结果显示，在乳腺癌（BRCA）、宫颈癌（CESC）、急性髓系白血病（LAML）、肺腺癌（LUAD）、皮肤黑色素瘤（SKCM）和葡萄膜黑色素瘤（UVM）等多种肿瘤中，低 TRA2β-PE 包含与患者总体生存率降低显著相关。这一发现为针对 TRA2β-PE 进行肿瘤治疗提供了重要的临床依据。
2. ASO - 1570 在多种肿瘤细胞系中诱导抗癌表型：在多种癌细胞系中，转染 ASO - 1570 后，60% 的细胞系出现 TRA2β-PE 包含和蛋白水平的变化，同时细胞死亡增加，增殖减少。其中，在 GBM U87MG、BLCA 5637、BRCA MDA - MB231 和 PRAD PC3 细胞系中效果最为显著。研究人员还通过构建缺乏 ASO - 1570 结合位点的细胞系，证实这些细胞表型是由 ASO - 1570 的靶向作用介导的，而非脱靶效应。
3. ASO - 1570 导致转录组的剧烈变化：对 U87MG 和 MDA - MB231 细胞进行 RNA - seq 分析发现，ASO - 1570 处理后，基因表达和 AS 事件发生了显著变化。在 U87MG 细胞中，50nM 和 200nM 的 ASO - 1570 分别诱导了 16,896 和 29,053 个 AS 事件；在 MDA - MB231 细胞中，相应剂量下分别诱导了 3,847 和 7,927 个 AS 事件。这些变化涉及许多与 RNA 加工、DNA 修复、p53 信号通路和 PI3K/AKT/mTOR 通路相关的基因。此外，研究还发现 ASO - 1570 处理影响了 RNA 结合蛋白（RNA - binding proteins，RBPs）和其他剪接因子的表达与剪接，且这些变化与 TRA2β 蛋白水平的降低以及其他剪接因子的补偿性变化有关。
4. ASO - 1570 诱导癌症相关通路的 AS 变化：在 p53 信号通路中，200nM 的 ASO - 1570 处理导致 26 个独特基因的剪接发生变化，其中 MDM2 基因的两个相邻外显子几乎完全跳过，使得 MDM2 蛋白表达丧失，p53 水平上调，进而解释了 ASO - 1570 处理后细胞增殖减少和死亡增加的现象。在 mTOR 信号通路中，50 个独特基因的剪接发生改变，例如 RPS6KB1 基因的一个外显子跳过，导致其编码的核糖体 S6 激酶（S6K）活性减弱，影响了 mTOR 信号通路的下游靶点。但研究也指出，RPS6KB1 剪接事件只是 ASO - 1570 诱导的众多 AS 事件中的一小部分，细胞表型的变化是多个 AS 事件干扰多个通路的综合结果。
5. 直接敲低 TRA2β 蛋白不能模拟 ASO - 1570 的效果：研究人员使用小干扰 RNA（small interfering RNAs，siRNAs）敲低 TRA2β 蛋白水平，发现细胞在死亡和增殖方面几乎没有变化，且对 AS 和基因表达的影响远小于 ASO - 1570 处理。此外，构建 TRA2β 基因敲除细胞系后发现，ASO - 1570 仍能增加 TRA2β-PE 的包含并降低细胞增殖，这表明 ASO - 1570 诱导的表型不仅仅是由 TRA2β 蛋白的消耗驱动的，还可能依赖于剪接的 TRA2β-PE 包含转录本的表达。
6. 核内剪接的 TRA2β-PE 包含转录本为 SFs 提供结合平台：研究发现，剪接的 TRA2β-PE 包含转录本在细胞核中富集，且 ASO - 1570 处理后其在细胞核中的含量增加。通过质谱分析和 RNA 下拉实验，鉴定出多个与 TRA2β-PE 结合的核蛋白，包括 DDX10、RBM15、NOLC1 和 DNAJC13 等。这些蛋白参与 RNA 加工、转录调控等重要过程，且与肿瘤的发生发展密切相关。进一步研究发现，同时敲低 TRA2β 和这些结合蛋白，能够部分模拟 ASO - 1570 对细胞增殖的影响，表明 TRA2β-PE 包含转录本通过结合并隔离核蛋白，发挥了类似 lncRNA 的功能，影响细胞的增殖。
7. ASO - 1570 在临床前体外和体内模型中显示出治疗前景：在 3D 细胞培养模型中，转染 ASO - 1570 的 U87MG 悬浮神经球和 MDA - MB231 3D 类器官的生长受到显著抑制，体积变小且更加碎片化。在体内 PDX 模型中，瘤内注射 ASO - 1570 的小鼠肿瘤生长速度明显慢于对照组，且高剂量 ASO - 1570 处理组的肿瘤体积在第 16 天显著低于对照组。RNA - seq 分析发现，ASO - 1570 处理的 PDX 肿瘤中，与染色质组织、DNA 修复、翻译和细胞周期相关的基因发生了 AS 变化，表明 ASO - 1570 可能通过影响这些基因的剪接来抑制肿瘤生长。

研究结论与讨论

本研究首次证实了靶向 TRA2β-PE 的 ASO - 1570 在多种肿瘤类型中的有效性，为治疗癌症提供了一种新的策略。研究表明，促进 TRA2β-PE 的包含不仅可以降低 TRA2β 蛋白的表达，还能诱导具有抗肿瘤作用的 lncRNA 的表达，这种双重作用机制使得 ASO - 1570 在肿瘤治疗中展现出巨大潜力。同时，研究还揭示了 ASO - 1570 诱导细胞毒性的分子机制，即通过下调 TRA2β 蛋白表达和上调核内 TRA2β-PE 包含转录本，隔离核蛋白，阻碍细胞内的正常生理过程，从而抑制肿瘤细胞的生长。

然而，目前 ASO - 1570 在临床应用中仍面临一些挑战，如如何提高其在体内的递送效率，以确保药物能够有效到达肿瘤细胞。此外，虽然研究表明 ASO - 1570 在多种肿瘤模型中具有良好的治疗效果，但不同肿瘤对其响应存在差异，如何根据肿瘤的特性进行个性化治疗也是未来需要解决的问题。尽管如此，本研究为后续进一步优化 ASO - 1570 的治疗方案提供了重要的理论基础。未来研究可致力于开发更有效的递送系统，提高 ASO - 1570 的疗效，同时深入研究其在不同肿瘤类型中的作用机制，探索与其他治疗方法联合使用的可能性，为癌症患者带来新的希望。