重大突破！RNA 与肼反应性研究新发现：为 RNA 修饰检测开辟前沿路径

为解决 RNA 修饰检测难题，德国歌德大学法兰克福分校的研究人员开展 RNA 及修饰与肼化学反应性的研究。结果表明无苯胺肼化学可用于检测多种修饰核苷。该研究为 RNA 修饰分析提供新方法，极具科研价值，推荐阅读。

　　

德国歌德大学法兰克福分校药物化学研究所（Institute of Pharmaceutical Chemistry, Goethe-University Frankfurt）的研究人员 Nur Ye?ilta?-Tosun、Yuyang Qi 等人在《Communications Chemistry》期刊上发表了题为 “Chemical reactivity of RNA and its modifications with hydrazine” 的论文。这篇论文在 RNA 修饰检测领域意义重大，为相关研究开辟了新方向，有助于深入理解 RNA 修饰在细胞过程调控以及疾病发生发展中的作用机制，为后续基于 RNA 修饰的疾病诊断和治疗策略开发提供了关键理论和技术支持。

研究背景

RNA 作为一种多功能生物分子，广泛参与基因调控、翻译、信息传递和应激反应等生命过程。细胞中的 RNA 由胞苷（C）、尿苷（U）、鸟苷（G）、腺苷（A）以及 170 多种常见结构单元的化学衍生物组成。假尿苷（Ψ）是最普遍的 RNA 修饰，由假尿苷合酶（PUS）催化尿苷异构化形成，存在于所有主要的 RNA 种类（tRNA、rRNA 和 mRNA）中，可增强 RNA 稳定性，影响 RNA 结构和蛋白质相互作用。此外，还有二氢尿苷（D）、7 - 甲基鸟苷（）、3 - 甲基胞苷（m3C）等修饰，它们在靶位点的位置和化学计量丰度受到精确调控，其缺失或过量与疾病（如癌症和神经系统疾病）的发生密切相关，这类疾病被称为修饰病（modopathies）。

然而，RNA 修饰的检测面临诸多挑战。以 Ψ 和 U 为例，它们是同分异构体，下一代测序（NGS）技术无法直接区分，因为在逆转录过程中，Ψ 和 U 都能与 A 成功配对；质谱（MS）检测也几乎无法区分二者，因为它们分子量相同（Mw 244 g/mol）。其他修饰核苷同样存在检测难题，区分常见核苷与修饰核苷、修饰核苷异构体都颇具挑战。为解决这些问题，化学工具应运而生，利用异构体的差异化学反应性，通过测序或 MS 检测修饰。但目前一些化学方法存在局限性，如某些化学方法会导致 RNA 链断裂，限制了其在长读长测序中的应用；基于肼（hydrazine）的检测方法虽能区分 Ψ 和 U，但存在 U 转化率未知、易造成 RNA 切割和非特异性副反应等问题，且仅适用于 NGS，无法用于纳米孔测序。

研究方法

1. 优化反应条件：研究人员将合成的 20 核苷酸长 RNA 或未修饰的 tRNA 异亮氨酸（）与不同浓度的肼在不同温度下孵育不同时间，通过经典聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）观察 RNA 完整性，利用同位素稀释质谱（LC - MS/MS）分析剩余常见核苷的数量，以此优化反应条件，实现几乎完全转化所有尿苷的同时避免 RNA 切割。
2. MALDI - MS 分析：用 30% 肼在 0°C 孵育合成的 20 核苷酸长 RNA 1 小时，沉淀后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - MS）分析；对未修饰的 tRNA 和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）天然 tRNA 进行肼处理后，用 RNase T1 消化，再进行 MALDI - MS 分析，以评估无苯胺肼处理是否适用于寡核苷酸质谱（ONTS - MS），并探究 RNA 结构对尿苷转化的影响。
3. LC - MS/MS 分析：将大肠杆菌（E. coli）或人胚胎肾细胞（HEK）的天然总 tRNA 与肼孵育，采用已建立的 LC - MS/MS 工作流程，对 20 种大肠杆菌 tRNA 修饰核苷和 23 种人 tRNA 修饰核苷进行定量分析，研究肼处理对 RNA 修饰的影响。
4. 高分辨率质谱分析：将市售修饰核苷冻干参考标准品溶解于水，进行无苯胺肼反应（0°C，1 小时，30%），冻干去除肼后，用高准确度飞行时间质谱（TOF - MS）分析，确定修饰核苷与肼反应的产物和产率。

研究结果

1. 原理验证：RNA 完整性和尿苷转化：研究人员发现，在无苯胺条件下，用 50% 肼在 4°C 孵育合成的 20 核苷酸长 RNA 长达 24 小时，RNA 未发生降解；用不同浓度肼在冰上处理未修饰的 1 小时，RNA 也未断裂。通过 LC - MS/MS 分析，在常用的 HydraPsiSeq 条件下，尿苷的转化率为 25%。这表明无苯胺肼可选择性降解尿苷，且不影响其他核苷或 RNA 的完整性。
2. 尿苷完全转化的反应条件优化：研究人员系统测试了反应条件的变化，发现延长在冰上的孵育时间可增加尿苷损失，且不影响其他常见核苷；较高的孵育温度（如 50°C）虽能使尿苷几乎完全损失，但会导致胞苷损失和 RNA 降解。综合优化实验结果，在 50% 肼 / 0°C 或 30% 肼 / 20°C 孵育 1 小时，尿苷转化率可达约 40%；延长孵育时间至 6 小时，30% 肼 / 10°C 条件下转化率超 70%，50% 肼 / 0°C 条件下转化率超 90%，且 RNA 保持完整。
3. 无苯胺肼处理适用于 MALDI - MS 分析 RNA：对合成的 20 核苷酸长 RNA 进行无苯胺肼处理后，MALDI - MS 分析出现了质量差为 52 Da 的新峰，表明尿苷转化为尿素 - 核糖。对未修饰 tRNA 和天然 tRNA 进行处理后发现，RNA 结构不是尿苷转化的影响因素，尿苷在高度结构化的 RNA 中也能发生转化。此外，无苯胺肼处理与纳米流反相色谱系统和高分辨率质谱（HRMS）兼容，通过 MS/MS 分析暗示尿苷转化呈随机分布。
4. 肼处理对天然 RNA 中 RNA 修饰的影响：研究发现，假尿苷、5 - 甲基尿苷（m5U）等部分修饰核苷在无苯胺条件下不与肼反应，而核糖甲基化尿苷（Um）部分反应，4 - 硫尿苷（s4U）、5 - 甲氧基羰基甲基 - 2 - 硫尿苷（mcm5s2U）、二氢尿苷（D）、N4 - 乙酰胞苷（ac4C）、3 - 甲基胞苷（m3C）等修饰核苷在肼处理后会减少或消失。不同修饰核苷对肼的反应性不同，部分修饰核苷在低浓度肼下就有较高反应性，且不同生物来源的 tRNA 中，某些修饰核苷（如和 t6A）对肼的反应存在差异。
5. 修饰核苷与肼的反应产物：通过高准确度 TOF - MS 分析，确定了修饰核苷与肼反应的产物。如 ac4C 的主要反应产物是 C，表明发生了肼诱导的去乙酰化；s4U、D 和等的反应机制独特，s4U 和 D 中 C4 作为亲电体与肼反应，与氢氧根离子（或羟基自由基）反应形成 N7 - 甲基 - FAPy - G。

研究结论与讨论

这项研究表明，无苯胺肼化学可与至少 8 种修饰核苷发生反应，且 RNA 磷酸二酯键保持完整。优化后的反应条件能使 RNA 中尿苷的破坏率高达 90%，虽高转化率可降低 NGS 中假阳性分配的风险，但可能干扰逆转录过程，不过对于纳米孔测序而言，高尿苷转化率有利于可靠检测 Ψ。此外，研究系统测定了无苯胺肼与重要 RNA 修饰反应的产率，发现大多数修饰核苷比尿苷反应更快，这对维持 NGS 中逆转录活性很重要。反应产物不太可能参与常规碱基配对，有望通过 NGS 和纳米孔测序检测到。

在 RNA 测序和 MS 分析方面，无苯胺肼化学与 MALDI - MS 和纳米 LC HRMS 兼容，可用于基于 MS 的鸟枪 RNomics 工作流程和全面的 RNA 修饰分析，有助于区分 tRNA 中 m5C 和 m3C 的位置。然而，在确定人类胞质 tRNA 修饰位置时仍面临挑战，如 tRNA 同工型众多，修饰谱存在差异，部分修饰核苷在某些 tRNA 家族中的丰度较低。

总的来说，无苯胺肼化学在使用测序和寡核苷酸 MS 检测各种修饰核苷方面具有巨大潜力，为 RNA 修饰分析提供了一种有价值的工具，有望推动 RNA 修饰领域的研究进展，助力相关疾病的诊断和治疗研究。