重大突破！核仁蛋白 NOL9——DNA 甲基化调控下驱动肝癌发展的关键 “引擎”，开启癌症诊疗新方向

为探究 HCC 发病机制，中山大学附属第三医院的研究人员开展 NOL9 在 HCC 中作用的研究。结果发现 NOL9 受 DNA 甲基化调控促进 HCC 生长。该研究为 HCC 诊疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

中山大学附属第三医院（Department of Infectious Diseases, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University）的研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Nucleolar NOL9 regulated by DNA methylation promotes hepatocellular carcinoma growth through activation of Wnt/β -catenin signaling pathway” 的论文。这篇论文在肝癌研究领域意义重大，为深入了解肝癌的发病机制以及开发新的诊断和治疗方法提供了关键线索。

研究概述

在这项研究中，研究人员聚焦于核糖体生物发生（Ribosome biogenesis，RiboSis）在乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染发展为 HBV 相关肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）过程中的作用，尤其关注核仁蛋白 9（Nucleolar protein 9，NOL9）对 HCC 发病机制和治疗反应的影响。研究发现，NOL9 在 HCC 组织中显著上调，与肿瘤大小和病理分级相关，且高表达 NOL9 的患者预后较差。进一步研究揭示，NOL9 的表达受 DNA 甲基化和转录因子 ZNF384 调控，它通过激活 Wnt/β -catenin 信号通路促进 HCC 细胞增殖 。

研究背景

HCC 是全球最常见的原发性肝癌，占比达 75 - 85%，尽管医疗有所进步，但它依旧致命，全球五年生存率低于 20%。早期诊断的患者生存率远高于晚期患者，因此探索 HCC 进展的分子机制对提升诊断和治疗策略至关重要。

癌细胞的无限增殖和高代谢需求依赖大量蛋白质合成，核糖体生物发生在其中起着核心作用。该过程涉及 RNA 聚合酶、核糖体蛋白和多种反式作用因子的协同活动。已有证据表明，核糖体生物发生不仅对肿瘤生长至关重要，还为 HCC 的预后和诊断提供关键信息。HBV 和丙肝病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染等风险因素会增强核糖体生物发生，促进肿瘤发生 。

研究人员关注的 NOL9 是参与核糖体生物发生的 5’多核苷酸激酶，在核糖体 RNA（ribosomal RNA，rRNA）前体切割和 28S rRNA 成熟过程中发挥关键作用。虽然此前有研究对其在核糖体生物发生和肿瘤发生中的作用有所了解，但 NOL9 对 HCC 发病机制的影响尚不清楚。

研究方法

1. 样本收集：研究人员收集了中山大学附属第三医院 2017 - 2019 年间 56 例接受介入手术的 HCC 患者的组织样本，并经术后病理确诊。同时从 The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库获取 50 例正常样本和 374 例 HCC 患者的 RNA 测序数据及临床记录。
2. 数据分析：运用多种 R 软件包进行数据分析，如用 “limma” 包比较基因表达差异，“clusterProfiler” 包进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析等。还利用 JASPAR 软件预测转录因子结合位点，GEIPA 数据库分析基因表达相关性。
3. 细胞实验：培养人 HCC 细胞系 HepG2、Huh7 和 HEK293T，通过 CCK - 8、EdU、集落形成实验检测细胞增殖能力；用流式细胞术分析细胞周期和凋亡；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测基因和蛋白表达水平；进行细胞转染、慢病毒包装构建稳定细胞系；运用甲基化特异性 PCR（Methylation-specific PCR，MSP）检测 NOL9 启动子区域甲基化状态。
4. 动物实验：选取 4 - 6 周龄 BALB/c 裸鼠进行体内成瘤实验，将细胞注射到小鼠右后肢皮下，观察肿瘤生长情况并计算体积和重量。

研究结果

1. NOL9 在 HCC 中上调且与患者生存相关：从乙肝到 HBV 相关 HCC 样本，核糖体生物发生评分逐渐增加，癌组织中更为显著，且核糖体生物发生评分高的 HCC 患者生存率更低。研究人员通过分析 TCGA - LIHC 队列发现，NOL9 高表达患者肿瘤更大、病理分级更高。ROC 曲线显示 NOL9 能有效区分 HCC 和正常样本。多因素分析后构建的列线图可预测 HCC 患者生存率。在研究人员自己的样本中也验证了 NOL9 在 HCC 中的高表达，且高表达 NOL9 与患者预后不良相关，在索拉非尼耐药的样本中 NOL9 蛋白水平更高。
2. NOL9 调节 HCC 细胞增殖和凋亡：在 NOL9 高表达的 Huh7 细胞系中敲低 NOL9，细胞增殖和集落形成能力显著下降，凋亡增加；在 NOL9 低表达的 HepG2 细胞系中过表达 NOL9，结果则相反。体内实验也证实，敲低 NOL9 的 Huh7 细胞在裸鼠体内形成的肿瘤生长明显减缓 。
3. NOL9 对细胞周期和核糖体 RNA 加工的影响：KEGG 和 GO 分析表明 NOL9 在细胞周期调控中起关键作用。过表达 NOL9 使细胞周期中 G1 期细胞减少，敲低 NOL9 则使 G1 期细胞增加。敲低 NOL9 还会降低 Cyclin D1 蛋白表达和 Rb 蛋白磷酸化水平。此外，NOL9 在核糖体 RNA 加工中也有重要作用，过表达 NOL9 会降低前体 rRNA 水平，提高 28S rRNA 水平，敲低 NOL9 则出现相反变化。
4. 转录因子 ZNF384 调节 NOL9 的表达：通过生物信息学分析预测潜在转录因子结合位点，转染 siRNA 实验发现 ZNF384 敲低对 NOL9 表达影响最大。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链式反应（Chromatin immunoprecipitation - quantitative polymerase chain reaction，ChIP - qPCR）证实 ZNF384 与 NOL9 启动子区域结合。同时，NOL9 启动子甲基化与 mRNA 水平呈负相关，DNA 甲基转移酶 1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）参与 NOL9 启动子的表观遗传调控，影响 ZNF384 与 NOL9 启动子的结合 。
5. NOL9 介导的细胞增殖依赖于 β - catenin：RNA 测序和 KEGG 富集分析表明 NOL9 介导的细胞增殖依赖 Wnt/β - catenin 信号通路。双荧光素酶报告基因实验显示 NOL9 可增加该信号通路活性。蛋白质免疫印迹结果表明，敲低 NOL9 抑制 β - catenin 蛋白表达，过表达则促进其表达。核质分离实验发现 NOL9 主要影响细胞质中 β - catenin 水平。此外，NOL9 还调节 Wnt/β - catenin 信号通路的关键调节因子糖原合酶激酶 3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK - 3β），敲低 NOL9 使 GSK - 3β 蛋白水平升高，同时降低下游靶基因 C - MYC 和 Cyclin D1 的 mRNA 水平。在 NOL9 下调的稳定细胞系中过表达 CTNNB1 可促进细胞增殖 。

研究结论与讨论

本研究表明，NOL9 在 HCC 组织中上调，促进肿瘤进展并影响对索拉非尼的耐药性。其表达受 DNA 甲基化和 ZNF384 调控，通过 β - catenin 依赖的途径促进 HCC 细胞增殖。这一发现凸显了 NOL9 作为 HCC 诊断生物标志物和治疗靶点的潜力 。

研究人员通过多方面的研究，深入揭示了 NOL9 在 HCC 中的作用机制。核糖体生物发生与细胞周期紧密相连，NOL9 作为其中的关键参与者，其失调可能导致基因组不稳定和肿瘤发生。DNA 甲基化和转录因子的相互作用精细调控 NOL9 表达，这为理解 HCC 的表观遗传调控提供了新视角。NOL9 对 Wnt/β - catenin 信号通路的调节则进一步阐释了其促进肿瘤细胞增殖的分子机制 。

不过，该研究也存在一些尚未解决的问题。未来需要进一步探索 NOL9 更广泛的调控网络和下游效应器，深入了解其在 HCC 发病机制中的全面功能。同时，针对 NOL9 及其相关通路的治疗意义也有待进一步研究，有望为克服 HCC 治疗耐药性、改善患者预后提供新策略 。

总体而言，这项研究不仅证实了 NOL9 在 HCC 中的致癌作用，还揭示了其调控机制和下游效应的新见解，为肝癌研究和治疗开辟了新方向，对推动肝癌领域的发展具有重要意义。