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为探究大肠杆菌合成 CdS QDs 过程中细胞形态变化及机制，智利安德烈斯?贝略大学研究人员开展相关研究。结果发现纳米颗粒在细胞极积累，诱导小细胞形成。该研究揭示细菌应对重金属新机制，对纳米生物技术等领域意义重大，值得一读。
智利安德烈斯?贝略大学生命科学学院生物信息学与整合生物学中心（Center for Bioinformatics and Integrative Biology, CBIB）生物纳米技术与微生物学实验室的 Felipe Valenzuela-Ibaceta 等人，在《Journal of Nanobiotechnology》期刊上发表了题为 “Production of minicell-like structures by Escherichia coli biosynthesizing cadmium fluorescent nanoparticles: a novel response to heavy metal exposure” 的论文。这篇论文在细菌应对重金属胁迫机制以及纳米生物技术领域意义重大，为深入理解细菌与重金属相互作用、优化纳米材料生物合成提供了全新视角 。
研究背景
细菌抵御重金属胁迫的机制研究对理解细胞生存和适应环境至关重要。量子点（Quantum Dots，QDs）是一类尺寸在 1 - 10nm 的半导体荧光纳米颗粒，因其独特光学性质在太阳能电池、污染物降解等领域应用广泛。细菌合成 QDs 作为一种应对重金属胁迫的方式备受关注，它能固定有害金属离子。在大肠杆菌（Escherichia coli）中，已有研究发现多种因素参与镉基 QDs 的生物合成，如磷酸盐浓度、硫代谢相关分子、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）以及一些与镉离子相互作用的蛋白质等。
然而，目前关于 QDs 生物合成对细胞形态影响的研究较少。此前，研究团队利用过表达 gshA 基因的大肠杆菌 AG1/pCA24NgshA 菌株合成镉 QDs 时，发现荧光发射集中在特定细胞结构，推测该过程可能与细胞膜应激或非经典分裂过程有关，或许涉及囊泡或类小细胞结构的形成。小细胞（Minicells）是通过极细胞分裂产生的球形细胞结构，缺乏染色体 DNA，无法进一步分裂，在细胞解毒过程中发挥重要作用。但野生型细胞在纳米颗粒生物合成条件下能否诱导产生小细胞表型尚不清楚。基于此，研究人员开展了此次研究，旨在揭示大肠杆菌在合成硫化镉（Cadmium Sulfide，CdS）QDs 过程中的形态变化以及小细胞形成与 QDs 生物合成的关系 。
研究方法
- 菌株培养：使用大肠杆菌菌株 AG1/pCA24N（野生型，空载体）和 AG1/pCA24NgshA（过表达大肠杆菌 gshA 基因），在添加氯霉素的溶原肉汤（Lysogeny Broth，LB）中 37°C 常规培养，保存于添加氯霉素的 LB 平板（2% 琼脂）4°C 环境。
- 蛋白质分析：采用标准十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS - PAGE）分析总蛋白。超声破碎不同条件下获得的细菌沉淀，离心后分别收集可溶性蛋白和不溶性蛋白，用 Bradford 法测定蛋白浓度，以 “Blue Prestained Protein Standard, Broad Range (11 - 250 kDa)” 为分子量标记，考马斯亮蓝 R - 250 染色观察蛋白条带。
- CdS 纳米颗粒生物合成：参照前人方法，将 AG1/pCA24NgshA 单菌落于含氯霉素的 LB 肉汤中过夜培养，稀释后培养至 OD600 约 0.5，加入异丙基 -β-D-1 - 硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导 4 小时，洗涤后暴露于 CdCl?，继续培养 18 小时，离心收集细胞用于后续分析，同时设置不加 CdCl?和使用 AG1/pCA24N 菌株的对照实验。
- 纳米颗粒纯化：从细胞沉淀中制备纳米颗粒，经 NaOH 处理、超声破碎、离心过滤、浓缩等步骤，使用酶标仪分析溶液光学性质，测定吸收光谱和荧光光谱。
- 荧光显微镜观察：将细胞沉淀洗涤重悬后，取少量样本于玻片上，在 MF606 荧光显微镜下观察，用 Fiji - ImageJ 软件分析荧光强度，R 软件绘图。随机选择视野测量细胞长度，进行长度动力学分析。
- 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察：对细胞沉淀进行固定、染色、渗透处理，制备超薄切片，用 Talos F200C G2 显微镜观察并拍照。
- 统计分析：运用 R 软件进行统计分析，采用 Kruskal - Wallis 检验进行组间比较，Dunn’s 检验进行事后分析，p 值小于 0.05 为有统计学意义，用 k - means 聚类分析处理后的细胞 。
研究结果
- CdS 纳米颗粒生物合成影响大肠杆菌大小动态并与小细胞形成相关：通过 SDS - PAGE 确认 AG1/pCA24NgshA 菌株中 GshA 蛋白的表达。经 IPTG 诱导并暴露于 CdCl?后，该菌株细胞产生荧光，证实 CdS QDs 的生物合成，而 AG1/pCA24N 菌株无荧光。荧光显微镜显示，荧光主要集中在细胞极，部分细胞荧光呈随机分布，还观察到球形小细胞的荧光发射。分析细胞长度发现，AG1/pCA24NgshA 菌株细胞尺寸普遍较小，镉暴露进一步影响细胞大小分布，该菌株在 CdCl?处理后出现约 1μm 大小的细胞亚群，与小细胞特征尺寸相符。聚类分析表明，镉暴露和 GshA 蛋白过表达均使细胞尺寸减小，二者共同作用对细胞大小影响更显著 。
- GshA 蛋白表达导致包涵体形成：TEM 观察发现，AG1/pCA24N 菌株在 CdCl?处理前后细胞形态变化不大，而 AG1/pCA24NgshA 菌株出现明显的椭圆形电子致密结构。该菌株含电子致密物质的细胞比例更高，且金属暴露后比例进一步增加。SDS - PAGE 分析显示，AG1/pCA24NgshA 菌株经 IPTG 诱导后部分 GshA 蛋白聚集，表明该菌株在生物合成条件下可能因 GshA 表达和镉胁迫产生包涵体 。
- 大肠杆菌中生物合成的纳米颗粒通过类小细胞结构排出细胞：TEM 观察 AG1/pCA24NgshA 菌株发现，细胞内电子致密物质在细胞极积累，细胞分裂时可 segregate 到子细胞，解释了部分细胞单极 QD 积累现象。同时，该菌株在生物合成条件下出现类小细胞形成表型，这些类小细胞缺乏 DNA，含有电子致密包涵体和纳米级物质，粒径主要在 5 - 10nm，与 CdS 纳米颗粒报道尺寸相符，表明 CdS QD 生物合成与小细胞产生有关 。
研究结论与讨论
本研究首次揭示了在未进行促进小细胞形成的基因改造的大肠杆菌中，小细胞形成与纳米颗粒生物合成之间的联系。此前研究表明小细胞在清除细胞内受损成分方面发挥作用，本研究进一步发现其在纳米颗粒生物合成中可能作为金属排出细胞的载体，为细菌应对重金属胁迫提供了新的解毒机制。
在细胞形态变化方面，荧光显微镜观察到细胞荧光发射的多种模式，结合细胞长度变化分析，推测 CdS QD 生物合成与细胞长度改变相关，AG1/pCA24NgshA 菌株中出现的约 1μm 大小的细胞亚群可能是小细胞，且小细胞产生依赖于 CdS QD 生物合成，进一步支持其作为解毒机制的作用。
TEM 分析证实了 AG1/pCA24NgshA 菌株中包涵体的形成，且生物合成的纳米颗粒可能与包涵体结合，通过细胞内蛋白质的极性定位机制，被转运到细胞极，随后在细胞分裂时发生不同命运，部分形成含纳米颗粒的子细胞，部分通过极分裂形成类小细胞排出纳米颗粒，这与细胞衰老模型中受损成分向细胞极转运的现象相符。
关于小细胞形成机制，可能是镉暴露导致细胞分裂相关基因普遍下调，影响 FtsZ、FtsQ 等关键分裂蛋白表达，干扰 “Z - 环” 形成，同时 Min 系统调控异常，以及 ZapB 蛋白表达下降等因素共同作用的结果，但具体分子机制仍需进一步研究。
综合研究结果，研究人员提出了 AG1/pCA24NgshA 菌株合成 CdS 纳米颗粒过程中的形态变化模型：IPTG 诱导 GshA 蛋白表达，增加细胞内 GSH 浓度并形成包涵体；添加金属前体启动纳米颗粒生物合成，纳米颗粒与包涵体结合后转运到细胞极；细胞随后进行正常分裂或极分裂，正常分裂产生含纳米颗粒或不含纳米颗粒的子细胞，极分裂则形成类小细胞排出纳米颗粒，实现细胞解毒 。
这项研究全面分析了大肠杆菌在合成 CdS 纳米颗粒过程中的形态变化，为理解细菌对重金属的响应提供了新维度，也为优化纳米颗粒生物合成及生物技术应用中纳米颗粒的排出策略提供了理论依据，对推动纳米生物技术和微生物学领域发展具有重要意义 。
