蛋白质组学新探：耐力赛马能量代谢适应机制的前沿洞察

为探究马匹耐力赛中的生理变化，萨格勒布大学兽医学院 Jelena Goti?等人开展蛋白质组学研究，发现 80km 耐力赛后血清多种蛋白丰度改变，反映能量代谢适应。该研究为马匹运动健康管理提供关键依据，值得科研读者一读。

　　

来自萨格勒布大学兽医学院内科学诊所（Clinic for Internal Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zagreb）的 Jelena Goti?等人在《BMC Veterinary Research》期刊上发表了题为 “Proteomic analysis emphasizes the adaptation of energy metabolism in horses during endurance races” 的论文。这篇论文对于深入了解马匹在耐力赛中的生理变化，以及相关疾病的防治和训练方案的优化有着重要意义。它为兽医学、运动生理学等领域提供了宝贵的研究数据，有助于提升马匹运动健康管理水平，保障马匹在耐力赛中的健康和竞技表现。

一、研究背景

耐力赛是对马匹体能要求极高的运动项目，比赛过程中的长时间有氧运动会引发马匹体内一系列生理变化，甚至可能造成机体损伤。大部分马匹能顺利完成比赛，但也有部分因代谢问题或跛行而退赛。在比赛过程中，马匹的血液流动会重新分布，导致内脏器官供血不足，而肌肉和皮肤的血液灌注增加，以此满足代谢需求并维持体温调节。同时，出汗会导致大量水分和电解质流失，若不能及时补充，可能引发脱水、电解质紊乱和酸碱失衡，进而导致马匹体力衰竭。

在能量代谢方面，耐力赛初期，马匹主要依靠碳水化合物供能；随着比赛的进行，后期则更多地依赖脂肪酸氧化。耐力训练能够促进肌肉毛细血管化，增加线粒体数量和酶活性，从而提高有氧代谢能力。

蛋白质在生物体内参与众多重要的生理过程，对其进行蛋白质组学分析，能够深入了解蛋白质的活性变化、相互关系，以及在生物过程模拟模型中的整合情况。定量蛋白质组学是一种高灵敏度和特异性的分析方法，通过对单个样本的分析，就可以识别和定量多种蛋白质。此前的研究表明，对耐力赛马的血液和肌肉样本进行蛋白质组学研究，有助于揭示其生化变化，评估训练效果。不过，关于马匹在耐力赛中复杂的代谢变化，仍有许多未知之处。本研究旨在通过蛋白质组学分析，深入探讨马匹在耐力运动过程中的复杂生物学反应，明确长时间有氧运动引起的血清蛋白质组变化，进而揭示马匹对耐力运动的适应机制。

二、研究方法

1. 实验动物：本研究选取参加 80 公里国家耐力赛的马匹作为研究对象。研究的参与是自愿的，每匹马的主人或骑手在比赛现场的首次兽医检查前，都签署了知情同意书。最初有 19 匹马报名参与研究，但最终只有 13 匹马符合研究标准（6 匹马未完成比赛，其中 1 匹退赛，4 匹因跛行、1 匹因代谢问题被淘汰）。这些马匹的平均年龄为 7.5（±1.5 SEM）岁，品种包括 8 匹阿拉伯马及阿拉伯杂交马和 5 匹温血马，性别上有 8 匹母马、3 匹阉割公马和 2 匹种马。
2. 血液采集：在比赛开始前 1 小时和比赛结束后 30 分钟，通过颈静脉穿刺采集血液样本，使用含有凝胶的真空采血管（Vacutainer?，Becton Dickenson，美国）收集血液用于血清分析。采集后的样本静置 30 分钟使其凝固，随后在 1096×g 的离心力下离心 15 分钟。血清样本在冷却袋中运输至实验室，并在采样后 4 小时内进行分装，储存于 - 80°C，以备后续分析。
3. 蛋白质组分析（LC-MS/MS）：采用基于串联质量标签（TMT）的定量方法对血清样本进行蛋白质组分析。首先使用 BCA 测定法（Thermo Scientific，Rockford，美国）测定总蛋白质浓度。取 35 微克样本总蛋白和内标，用 0.1 M 碳酸氢三乙铵（TEAB，Thermo Scientific，Rockford，美国）稀释至 50 微升，加入 2.5 微升 200 mM 二硫苏糖醇（DTT），在 55°C 条件下反应 60 分钟进行还原；然后加入 2.5 微升 375 mM 碘乙酰胺，在黑暗中烷基化 30 分钟；接着用 300 微升丙酮在 - 20°C 沉淀过夜。离心（9000×g，4°C）后，将蛋白质沉淀溶解在 50 微升 0.1 M TEAB 中，并加入 1 微升胰蛋白酶（1 mg/mL，Promega），在 37°C 消化过夜（胰蛋白酶与蛋白质的比例为 1:35）。
   按照制造商的步骤制备 TMT 六重试剂（Thermo Scientific，Rockford，IL，美国），向每个样本中加入 19 微升 TMT 标签，室温孵育 1 小时后，用 5% 羟胺（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，美国）终止反应，并将标记的样本混合。
   使用 Ultimate 3000 RSLCnano 系统（Dionex，Germering，德国）与 Q Exactive Plus 质谱仪（Thermo Fisher Scientific，Bremen，德国）联用，对 TMT 标记的肽段进行高分辨率液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析。肽段溶解在加载溶剂（1% 乙腈，0.1% 甲酸）中，加载到捕集柱（C18 PepMap100，5μm，100?，300μm×5mm）上，然后在分析柱（PepMap RSLC C18，50cm×75μm）上进行分离，流动相 B（0.1% 甲酸的 80% 乙腈溶液）在 120 分钟内从 5% 线性梯度增加到 45%，流动相 A 为 0.1% 甲酸的水溶液。采用纳米喷雾 Flex 离子源（Thermo Fisher Scientific，Bremen，德国）进行电离，该离子源含有一个内径为 10μm 的二氧化硅尖端发射器（New Objective，美国）。质谱仪在正离子模式下运行，采用 DDA Top8 方法，全扫描质谱范围为 m/z 350.0 - m/z 1800.0，分辨率为 70,000，注入时间 120 ms，自动增益控制（AGC）目标为 1×10?，隔离窗口 ±2.0 Da，动态排除时间 30 s。采用高能碰撞解离（HCD）进行碎裂，碰撞能量为 29% 和 35% 归一化碰撞能量（NCE），分辨率为 17,500，AGC 目标为 2×10?。排除未分配电荷状态或电荷状态为 + 1 或大于 + 7 的前体离子进行碎裂。
   使用 Proteome Discoverer（版本 2.0，Thermo Fisher Scientific）中的 SEQUEST 算法进行蛋白质鉴定和定量。根据以下参数对犬狼疮（Canis lupus）FASTA 文件（2019 年 4 月 4 日从 NCBI 数据库下载，共 172,083 条序列）进行数据库搜索：允许两个胰蛋白酶错切位点，前体质量容差为 10 ppm，片段质量容差为 0.02 Da，固定肽修饰为氨甲酰甲基（C），动态修饰为氧化（M）、脱酰胺（N,Q）和 TMT 六重标记（K，肽 N 端）。使用 Proteome Discoverer 工作流程中的 Percolator 算法计算肽段鉴定的错误发现率（FDR），并设定为 1%。报告可靠鉴定的蛋白质至少需要两个独特肽段且 FDR 为 1%。
4. 蛋白质组学结果验证：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和生化测定法，对同一批马匹血清样本进行蛋白质组学结果验证。使用马特异性竞争性 ELISA 试剂盒（LSBio，LifeSpan BioSciences, Inc.，西雅图，美国）测定载脂蛋白 E（ApoE）；采用自动化分光光度法测定结合血红蛋白的触珠蛋白（HP）浓度，该方法参考 Eckersall 等人的描述并根据 Brady 等人的方法进行了修改。在分析性能方面，按照之前描述的方法计算测定的精密度和准确度。通过制备不同马样本的混合池来评估批内精密度，将混合池分成小份并储存在 - 20°C 的塑料瓶中，用于评估批间精密度。在单次测定运行中对混合池进行 6 次分析，计算批内变异系数（CV）；在不同日期进行 5 次独立运行，分析相同样本，测定批间 CV。通过稀释线性评估测定的准确度，即将血清混合池用试剂盒提供的稀释剂进行系列稀释并分析，比较分析物的测量浓度与预期水平。
5. 统计和生物信息学分析：使用 R v3.2.2 进行统计分析。对于配对样本中数据缺失的蛋白质，将其排除在分析之外。由于大多数鉴定出的蛋白质不服从正态分布（通过 Shapiro-Wilk 检验），因此使用 Wilcoxon 符号秩检验来检验组间（赛前和赛后）蛋白质丰度的差异。应用错误发现率（FDR）P 值校正，当 FDR < 0.05 时，认为蛋白质具有统计学意义。两组之间的倍数变化计算为（赛后平均值）/（赛前平均值），并以 log?尺度表示。使用 R 包 ggplot2 v3.1.1 生成火山图，使用 clusterProfiler v3.16.1 和 ReactomePA v1.32.0 包进行功能富集分析。
   对于验证实验，使用 GraphPad Prism 5（GraphPad Software Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚）进行统计分析。通过 Wilcoxon 符号秩检验评估赛前和赛后浓度的差异，数据以平均值、中位数、四分位数间距和标准差（SD）表示。P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

三、研究结果

1. 蛋白质鉴定与分析：血清分析共鉴定并定量了 1525 种蛋白质，其中 1246 种因不符合设定标准（2 个独特肽段和 5% FDR）被排除在分析之外。最终鉴定出 279 种蛋白质，其中 191 种满足配对样本分析条件（13 匹马赛前和赛后均无数据缺失）。
2. 差异表达蛋白质：统计分析显示，有 10 种主要蛋白质在赛前和赛后的丰度存在显著差异（FDR 校正后 P 值 < 0.05）。其中，微原纤维相关糖蛋白 4（MFAP4）、转铁蛋白（Transferrin）、抗凝血酶 III（Antithrombin III）以及载脂蛋白 A4（ApoA IV）和 E（ApoE）的丰度在赛后增加；而触珠蛋白（Haptoglobin）、α-1 - 微球蛋白 / 比 Kunin 前体蛋白（AMBP）以及载脂蛋白 C2（ApoC2）、C3（ApoC3）和 R（ApoR）的丰度在赛后降低。
3. 火山图分析：生成的火山图直观地展示了马匹赛前和赛后蛋白质组的不同反应。蓝色点代表下调的蛋白质，红色点代表上调的蛋白质。从图中可以清晰地看出蛋白质丰度的变化情况，进一步验证了差异表达蛋白质的结果。
4. 基因本体（GO）分析：GO 分析结果表明，赛前和赛后丰度差异显著的血清蛋白质参与了甘油三酯和酰基甘油稳态、脂质定位调节、甘油三酯分解代谢过程等生物学过程；在分子功能方面，这些蛋白质具有酶抑制剂活性、胆固醇结合、甾醇结合、抗氧化活性等功能；在细胞组成上，它们与血液微粒、乳糜微粒和含胶原蛋白的细胞外基质相关。
5. Reactome 通路分析：Reactome 通路分析（FDR 校正后 P 值 < 0.05）显示，大多数丰度存在差异的蛋白质参与了血浆脂蛋白的组装、结合和摄取、高密度脂蛋白（HDL）重塑等通路。
6. 验证实验结果：本研究中评估的所有测定方法均具有良好的精密度，批内和批间 CV 均低于 15%，达到了精度客观分析性能标准的限值（FDA 2001）。准确性方面，所有测定的线性回归方程系数均接近 1.0（R2 > 0.98）。对 ApoE 和触珠蛋白的验证实验表明，这两种蛋白质在马匹赛前和赛后的浓度存在显著差异。赛后 ApoE 浓度显著升高（中位数，四分位数间距：109.3 μg/ml，88.95 - 125.40 μg/ml），而触珠蛋白浓度显著降低（0.49 g/L，0.37 - 0.71 g/L），与蛋白质组学结果一致，证实了蛋白质组学结果的可靠性。

四、研究结论与讨论

本研究通过蛋白质组学分析，发现马匹在 80 公里耐力赛后，血清中多种蛋白质的丰度发生了显著变化。这些变化反映了马匹在耐力运动过程中的代谢适应机制，主要体现在能量代谢的调整上，尤其是对脂质的利用增加，以满足骨骼肌在耐力赛中的能量需求。

从载脂蛋白的变化来看，ApoA IV 和 ApoE 的增加，以及 ApoC-II、ApoC-III 和 ApoR 的减少，表明耐力赛促进了脂质代谢。ApoA IV 的上调可能与长链脂肪酸吸收增加有关，它能促进脂蛋白脂肪酶（LPL）活性，水解甘油三酯为游离脂肪酸，为肌肉组织提供能量或在脂肪组织储存能量，同时还可能具有抗凋亡作用。ApoC-II 丰度的降低是由于 LPL 激活，更多的 ApoC-II 与脂蛋白结合，导致循环中的 ApoC-II 减少，这也意味着脂肪利用的增加。ApoE 丰度的增加则与脂质代谢增强和极低密度脂蛋白（VLDL）利用增加有关。ApoC-III 的减少可能促使富含甘油三酯的脂蛋白向肌肉转运，以满足肌肉的能量需求。

触珠蛋白和 AMBP 的变化也具有重要意义。触珠蛋白是一种负急性期反应蛋白，在溶血过程中能够结合游离血红蛋白。本研究中触珠蛋白丰度的降低，可能是由于运动诱导的血管内溶血，导致游离血红蛋白增加，消耗了触珠蛋白；也可能与受损肌肉纤维释放的肌红蛋白有关。AMBP 蛋白水平的下降可能意味着其下游产物比 Kunin 的合成增加，这可能与运动对关节稳态的影响有关。

转铁蛋白和抗凝血酶 III 的变化同样值得关注。转铁蛋白水平在赛后升高，可能是由于运动诱导的血管内溶血，导致血清中铁离子释放增加，转铁蛋白负责运输这些铁离子。抗凝血酶 III 水平的升高则表明，耐力赛可能抑制了凝血过程，这与之前一些关于运动对止血影响的研究结果相符。

MFAP4 作为一种细胞外基质糖蛋白，其血清水平在赛后升高。虽然目前其确切功能尚不完全清楚，但已有研究表明它可能是多种疾病的潜在生物标志物。本研究结果提示，在将 MFAP4 作为疾病生物标志物时，需要考虑运动因素的影响。

然而，本研究也存在一定的局限性。研究参与的自愿性可能导致样本选择存在偏差，且关于马匹的饲养、管理、赛前运输等信息有限。研究群体相对较小，样本采集在比赛期间进行，受到诸多限制，无法进行全面的临床检查，也未收集训练方案、既往健康问题、尿液颜色变化和饲料补充剂等数据，同时未对赛后可能的血液浓缩进行变量校正。

尽管存在这些不足，本研究仍然为我们理解马匹在耐力运动中的生理适应机制提供了重要的见解。这些发现有助于深入了解耐力马代谢和骨科疾病的病理生理机制，为制定更科学的训练计划、优化营养方案以及预防和治疗相关疾病提供了理论依据，在马匹运动医学领域具有重要的意义。未来的研究可以进一步扩大样本量，全面收集相关信息，深入探讨蛋白质变化与运动表现、健康状况之间的关系，为马匹的健康管理和竞技水平提升提供更有力的支持。