CHI3L1—— 膀胱癌进展与 M2 巨噬细胞关联的关键 “密码” 及潜在治疗新靶点

为解决膀胱癌（BCa）预后差、治疗靶点缺乏的问题，兰州大学第二医院的研究人员开展了 BCa 与 M2 巨噬细胞相关基因的研究。发现 CHI3L1 促进 BCa 进展，且与 M2 巨噬细胞浸润有关。该成果为 BCa 治疗提供新靶点，极具科研价值，推荐阅读。

　　

兰州大学第二医院的研究人员在《BMC Cancer》期刊上发表了题为 “Chitinase 3 like 1 promotes bladder cancer progression through the PI3K-Akt signaling pathway and is associated with M2 macrophage infiltration” 的论文。这篇论文在膀胱癌研究领域意义重大，为深入了解膀胱癌的发病机制、寻找潜在治疗靶点以及改善患者预后提供了新的思路和依据。

研究背景

膀胱癌（Bladder cancer，BCa）是泌尿系统中最为常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，其发病率和死亡率都不容小觑，分别在恶性肿瘤中排名第 10 位和第 13 位。国际癌症研究机构（IARC）2020 年的数据显示，膀胱癌的发病率和死亡率呈上升趋势，在男性泌尿生殖系统肿瘤中，其发病率仅次于前列腺癌。膀胱癌主要分为非肌肉浸润性膀胱癌（non - muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌肉浸润性膀胱癌（muscle - invasive bladder cancer，MIBC），其中 MIBC 患者的 5 年生存率较低，预后较差，肿瘤大于 3cm 更是被视为复发和进展的危险因素。尽管在早期 BCa 检测方面取得了一些进展，但患者的死亡率改善有限，对于转移性 BCa，术后化疗虽为主要治疗手段，但受肿瘤异质性和化疗耐药性影响，疗效不佳。因此，探寻新的标记靶点、明确 BCa 进展和化疗敏感性的机制，对推进 BCa 精准治疗至关重要。

以往研究表明，肿瘤的发展不仅取决于肿瘤细胞自身的基因改变，肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）也发挥着重要作用。TME 中存在大量肿瘤浸润免疫细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（Tumor - associated macrophages，TAMs）和各类淋巴细胞，它们通过释放细胞因子和生长因子影响肿瘤细胞的增殖、存活、迁移和侵袭。TAMs 可分为 M1 和 M2 两种类型，与肿瘤不良预后相关。在肿瘤发生早期，TAMs 倾向于极化为 M1 型，发挥抑制肿瘤的作用；而随着肿瘤进展到免疫逃逸阶段，TAMs 在肿瘤细胞和间质细胞分泌的因子影响下极化为 M2 型，M2 巨噬细胞可通过多种途径促进肿瘤生长和转移，还与肿瘤的化疗耐药性相关。因此，研究 M2 巨噬细胞促进癌症的机制成为 BCa 治疗研究的一个有前景的方向。

研究方法

1. 数据收集：研究人员从 TCGA 数据库收集了 431 例 BCa 患者的基因表达、临床病理特征和预后数据；同时，按照伦理规范，收集了 5 例 BCa 患者和 5 例健康个体的新鲜尿液样本，并获取了来自 GEO 数据库的 GSE49240 数据集，该数据集包含从献血者血沉棕黄层分离的单核细胞衍生巨噬细胞的基因表达谱。
2. LC - MS/MS 分析：利用 Q Exactive 质谱仪和 Easy nLC 进行 LC - MS/MS 分析，对尿液样本中的蛋白质进行分离和鉴定。流动相 A 为 2% 乙腈（ACN）和 0.1% 甲酸，流动相 B 为 80% ACN 和 0.1% 甲酸，通过特定的梯度洗脱样本，使用 Orbitrap 质量分析仪进行数据采集，并利用 MASCOT 引擎和 Proteome Discoverer 1.4 软件对数据进行分析。
3. 筛选差异表达基因（DEGs）：运用三种机器学习算法，即最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator，LASSO）、递归特征消除结合支持向量机（Recursive Feature Elimination - Support Vector Machine，RFE - SVM）以及随机森林（Random Forest，RF）算法，对数据进行特征选择，筛选出与 M2 巨噬细胞相关且与 BCa 进展相关的 DEGs。
4. 功能分析：借助 R 语言的相关包，获取基因本体论（Gene Ontology，GO）术语和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路，探究 DEGs 的生物学功能，分析其在生物过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cell Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）方面的作用。
5. 不同临床特征分析：依据 CHI3L1 的中位表达水平，将 TCGA 数据库中临床数据完整的患者分为 CHI3L1 高表达组和低表达组，采用卡方检验分析 CHI3L1 与 BCa 临床症状之间的相关性。
6. 细胞实验：培养多种膀胱癌细胞系（如 UMUC3、5637、T24、J82）和正常膀胱上皮细胞系 SV - HUC - 1，对 J82 和 UMUC3 细胞进行转染，构建稳定干扰 CHI3L1 表达的细胞系。运用 CCK - 8 法检测细胞活力，通过伤口愈合实验、Transwell 迁移和侵袭实验评估细胞迁移和侵袭能力，进行集落形成实验观察细胞增殖能力，采用蛋白质免疫印迹法（Western blot analysis）检测蛋白质表达水平。
7. 动物实验：构建裸鼠皮下肿瘤模型，将稳定干扰 CHI3L1 表达的 UMUC3 细胞和对照组细胞分别注射到裸鼠右腋，观察肿瘤形成、体积和重量变化，通过免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）检测相关蛋白表达。
8. 统计分析：使用 GraphPad Prism 软件进行数据分析，数据以均值 ± 标准差表示，采用单因素方差分析（One - way analysis of variance，ANOVA）和 Tukey - Kramer 检验评估组间差异，以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。

研究结果

1. BCa 尿液样本中 DEGs 的鉴定及富集分析：在 5 例 BCa 患者和 5 例健康个体的新鲜尿液样本中，共鉴定出 760 个 DEGs。通过 GO 富集分析发现，这些基因在淋巴细胞介导的免疫、细胞 - 底物粘附和泌尿生殖系统发育等生物学过程中显著富集；在细胞成分方面，主要涉及粘着斑、细胞 - 底物连接和免疫球蛋白复合物等；在分子功能上，与免疫球蛋白受体结合、钙粘蛋白结合和细胞因子结合相关。KEGG 通路富集分析表明，这些 DEGs 与细胞粘附分子、癌症中的蛋白聚糖和 PI3K - Akt 信号通路等有关。
2. CHI3L1 作为关键基因的鉴定：通过对 TCGA - BLCA 数据集和 GSE49240 数据集的分析，结合 Venn 图筛选出 19 个与 BCa 中 M2 巨噬细胞密切相关的基因。进一步运用三种机器学习算法进行特征选择，并对相关基因进行生存分析，最终确定 CHI3L1 为关键基因。
3. CHI3L1 与 BCa 不同临床特征的关联：分析发现，CHI3L1 表达与患者年龄和性别相关，在 70 岁以上患者和女性患者中表达较高；与 TNM 分期中的 T 期和 N 期呈正相关，在非乳头状肿瘤、更高级别的组织学分期和病理学分期中表达更高，但与患者吸烟状态无明显相关性。
4. CHI3L1 对 BCa 细胞体外增殖、迁移和侵袭的抑制作用：利用慢病毒降低 BCa 细胞中 CHI3L1 的表达，转染效率经 Western blot 分析验证。CCK - 8 实验、集落形成实验表明，下调 CHI3L1 可抑制 BCa 细胞活力和增殖能力；伤口愈合实验和 Transwell 实验显示，CHI3L1 表达降低能明显抑制细胞迁移和侵袭能力。此外，CHI3L1 下调还可增加 BCa 细胞对吉西他滨（gemcitabine，GEM）的敏感性。
5. PTX 通过抑制 CHI3L1 减弱 BCa 细胞增殖、迁移和侵袭：使用 FDA 批准的 CHI3L1 特异性抑制剂己酮可可碱（pentoxifylline，PTX）进行实验，结果显示 PTX 能抑制 J82 和 UMUC3 细胞的生长，IC50 分别为 6.95 mM 和 3.05 mM。CCK - 8 实验、集落形成实验、伤口愈合实验和 Transwell 实验均表明，PTX 处理后，BCa 细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到显著抑制。
6. PTX 增强 GEM 对 BCa 细胞活性的抑制作用：GEM 是 BCa 化疗的重要药物，但对肌肉浸润性或转移性 BCa 的缓解率仅为 49%，且易复发和耐药。实验发现，PTX 与 GEM 联合使用，可显著降低 J82、UMUC3 和 T24 细胞的活性，表明 PTX 能增强 GEM 对 BCa 细胞活性的抑制作用。
7. CHI3L1 通过 PI3K/AKT 信号通路调节 BCa 进展：通过对与 CHI3L1 相互作用的蛋白质和相关基因进行分析，发现 CHI3L1 与巨噬细胞激活、单核细胞增殖和趋化调节等过程相关，KEGG 通路富集分析显示其与 PI3K - Akt 信号通路等密切相关。进一步实验表明，敲低 CHI3L1 可抑制 PI3K - Akt 信号通路，影响 BCa 细胞功能。
8. 下调 CHI3L1 表达抑制体内肿瘤生长：将稳定干扰 CHI3L1 表达的 UMUC3 细胞和对照组细胞注射到裸鼠体内构建肿瘤模型，结果显示，CHI3L1 稳定干扰组的肿瘤体积和重量明显低于对照组，且该组中 CHI3L1、KI67 和 p - AKT 表达降低，E - cadherin 表达增加，表明降低 CHI3L1 表达可抑制 BCa 进展。
9. CHI3L1 表达与免疫特征的相关性：利用 TIMER 数据库分析发现，BCa 患者中，高 CHI3L1 表达组的多种免疫细胞（如 aDC、B 细胞、CD8 + T 细胞等）浸润水平显著高于低表达组，但 NK CD56 bright 细胞和 Th17 细胞浸润水平较低。CHI3L1 表达与巨噬细胞浸润相关性最强，还与多种免疫细胞浸润呈正相关，与 Th17 细胞和 CD56 bright 细胞浸润呈负相关。
10. CHI3L1 表达与 M2 巨噬细胞浸润和极化的关联：通过多种算法分析发现，CHI3L1 表达与巨噬细胞浸润水平呈正相关，与 M2 巨噬细胞浸润也呈正相关，且与 M2 巨噬细胞标记物（如 CD163、MRC1 等）存在显著关联。

研究结论与讨论

本研究通过多组学分析和实验验证，发现 CHI3L1 在膀胱癌的发生发展中扮演着重要角色。CHI3L1 在 BCa 中高表达，且与患者预后不良相关，它能够影响 BCa 细胞的增殖、侵袭、迁移以及对 GEM 的药物敏感性。机制研究表明，CHI3L1 通过 PI3K - AKT 信号通路调节膀胱癌的进展，并且与 M2 巨噬细胞浸润和极化密切相关，提示 CHI3L1 可能是 M2 巨噬细胞促进 BCa 进展的关键因素。此外，PTX 作为 CHI3L1 的抑制剂，可有效抑制 BCa 细胞的多种恶性行为，增强 GEM 的治疗效果，有潜力作为 BCa 治疗的辅助药物进一步研究。

这项研究的意义在于，为膀胱癌的诊断、预后评估和治疗提供了新的潜在生物标志物和治疗靶点。CHI3L1 有望成为预测膀胱癌患者预后的重要指标，针对 CHI3L1 及其相关信号通路的干预措施可能为膀胱癌的治疗开辟新的途径，有助于推动膀胱癌精准治疗的发展，改善患者的生存状况。