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为探究先天免疫受体对脑内皮细胞（CEC）功能及血脑屏障（BBB）的影响，新泽西州立大学研究人员聚焦 TLRs 和炎性小体展开研究。结果揭示其在 BBB 破坏和神经炎症中的作用。推荐阅读，助您把握该领域前沿进展。
新泽西州立大学新泽西医学院基因组中心（New Jersey Medical School, The Genomics Center, Rutgers the State University of New Jersey）的研究人员 Cigdem Acioglu 和 Stella Elkabes 在《Journal of Neuroinflammation》期刊上发表了题为 “Innate immune sensors and regulators at the blood brain barrier: focus on toll-like receptors and inflammasomes as mediators of neuroimmune crosstalk and inflammation” 的论文。这篇论文在神经炎症、血脑屏障相关疾病研究领域意义重大，为深入理解血脑屏障（BBB）的免疫调节机制以及相关疾病的治疗靶点探索提供了关键依据。
一、研究背景
大脑拥有一套复杂的血管网络，血脑屏障在其中发挥着关键作用。血脑屏障是一种动态的代谢和物理屏障，它严格限制循环中的大分子、毒素、病原体和免疫细胞进入脑实质，同时允许必需的营养物质和能量底物通过被动渗透或主动运输进入大脑。一旦血脑屏障受损，就会破坏大脑的内环境稳定，导致免疫细胞渗入大脑，还会引起分子运输的调节异常。在正常衰老、中枢神经系统（CNS）感染、脑损伤以及神经退行性和精神疾病等多种情况下，血脑屏障常常会受到损害。
构成血脑屏障主要成分的是高度特化的脑内皮细胞（CEC）。此外，脑周细胞（嵌入基底膜）和星形胶质细胞（其末端紧密包裹血管）也是血脑屏障的重要组成部分，它们能够调节 CEC 的功能和血脑屏障的通透性。而且，CEC 具有独特的性质，它与外周血管中的内皮细胞不同，相邻的 CEC 通过紧密连接相互连接，缺乏窗孔，囊泡运输水平较低，胞吞作用也受到抑制。这些紧密连接由跨膜蛋白 Occludin、Claudins 以及细胞质衔接蛋白 Zona Occludens（ZO）等蛋白质形成复合物并与细胞骨架相连，从而封闭细胞间的空间。然而，在神经病理学中，紧密连接蛋白水平的变化、细胞定位错误以及蛋白复合物的解体，都是导致血脑屏障通透性增加的主要因素。
值得注意的是，CEC 还具有许多神经免疫细胞的特征，它能够释放细胞因子和趋化因子，并对多种细胞因子做出反应。不仅如此，CEC 还表达先天免疫受体，这些受体是抵御病原体和内源性威胁的第一道防线。在感染和组织损伤时，先天免疫受体能够感知危险并启动强烈的急性炎症反应，旨在消除危险。但如果炎症持续存在且无法解决，就可能导致有害的后果。Toll 样受体（TLRs）和炎性小体作为先天免疫受体中的重要成员，在 CEC 的免疫功能以及血脑屏障的完整性维持方面扮演着至关重要的角色，因此对它们的深入研究显得尤为必要。
二、研究方法
在这项研究中，研究人员采用了多种先进的实验技术和模型。体外实验方面，使用脑内皮细胞（CEC）单层培养在带有微孔膜的 Transwell 小室中，这种模型可以很好地模拟血脑屏障的管腔侧和基底外侧环境，使 CEC 能够维持受体和转运体的极化表达，从而便于研究不同刺激对 CEC 的影响。在细胞和分子生物学技术上，运用转录谱分析来研究基因表达变化，通过检测细胞因子、趋化因子、黏附分子等的表达水平，深入了解细胞的免疫反应机制。同时，利用基因敲除小鼠模型进行体内实验，比如内皮细胞条件性 Tlr4 敲除小鼠、Lbp-/-、Cd14-/-、Casp11-/- 和 Gsdmd-/- 小鼠等，通过对比野生型和基因敲除小鼠在受到刺激后的差异，明确特定基因在血脑屏障功能和免疫反应中的作用。
三、研究结果
- Toll 样受体（TLRs）
- TLRs 在 CEC 和周细胞中的表达与功能：外周血管的内皮细胞表达 PRRs，其中就包括 TLRs，CEC 同样表达多种 TLRs，如 TLR2、TLR3、TLR4、TLR6 和 TLR9 等。细胞因子（如 IL-1β 和 TNF-α）和氧化应激能够上调 CEC 中 TLR 的表达，而肥大细胞释放的丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶则会增加 TLR4 的表达，同时降低紧密连接蛋白的表达。研究发现，血液中循环的危险相关分子模式（DAMPs）和病原体相关分子模式（PAMPs）能够被 CEC 管腔侧的 TLRs 识别，进而释放促炎介质进入大脑影响脑功能；而在脑部感染、损伤或神经退行性疾病中，存在于脑部的 DAMPs 或 PAMPs 会激活 CEC 基底外侧的 TLRs，导致炎症介质释放到血液中。例如，将 TLR4 配体脂多糖（LPS）应用于 CEC 单层培养的管腔侧或基底外侧时，均会诱导细胞因子在管腔隔室中释放，并且 IL-6 的释放呈现出极性差异，当 LPS 应用于基底外侧时，管腔隔室中 IL-6 的释放量更高。
- TLRs 在脑损伤中的调节作用
- 缺血性中风：在缺血性中风的动物模型和体外实验中，CEC 中的 TLR4 信号与血脑屏障功能障碍有关。研究以大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型和 CEC - 星形胶质细胞共培养的氧糖剥夺（OGD）细胞模型为研究对象，发现 TLR4 信号与 CEC 中通透性糖蛋白（P - 糖蛋白）的表达和活性存在关联。MCAO 诱导的 P - 糖蛋白表达和活性上调，与 TLR4 表达增加和 NF - κB 激活并行。预先用 TLR4、NF - κB 或 HMGB1 抑制剂处理大鼠，能够阻止 P - 糖蛋白表达和活性的变化，这表明缺血后，反应性星形胶质细胞可能释放的 HMGB1 会诱导 CEC 中的 TLR4/NF - κB 信号通路，进而影响 CEC 功能。
- 出血性中风：出血性中风有时是由于脑海绵状畸形（CCM）破裂导致的，而 CEC 功能障碍与 CCM 的形成有关。研究发现，全身给予革兰氏阴性菌或 LPS 会加速 CCM 的形成，而 CEC 中单个或两个 tlr4 等位基因缺失则会减弱 CCM 的形成。在人类中，TLR4 及其共受体 CD14 的单核苷酸多态性与病变数量增加有关，这表明内皮细胞管腔侧表达的 TLR4 在 CCM 形成过程中起着关键作用。
- 创伤性脑损伤：研究表明，LPS 预处理能够对创伤性脑损伤（TBI）起到神经保护作用。对小鼠进行重复的低剂量 LPS 全身预防性预处理，可保护大脑免受 TBI 损伤，且不影响血脑屏障通透性、紧密连接完整性以及 claudin - 5 和 occludin 水平。LPS 预处理激活 CEC 并诱导差异基因表达，上调的转录本包括细胞因子和趋化因子，尤其是 C - X - C 基序趋化因子配体 10（CXCL10），同时还会观察到小胶质细胞激活。选择性删除 CEC 中的 MyD88 会阻止 LPS 诱导的 CXCL10 表达增加和小胶质细胞激活，而选择性删除 CEC 中的 cxcl10 则会消除 LPS 在脑损伤后的神经保护作用。
- TLRs 在感染中的调节作用
- HIV 感染：早期研究显示，CEC 中的 TLR3 信号能够触发针对人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的 IFN 依赖性先天免疫反应。病毒来源的双链 RNA 是 TLR3 的配体，在实验条件下，聚肌胞苷酸 [Poly（I:C）] 作为合成的双链 RNA 被用于激活 TLR3。在人类 CEC 培养物中，Poly（I:C）激活干扰素调节转录因子 3（IRF3）和 IRF7，它们转位到细胞核后会导致 IFN - β 和 IFN - γ 表达增加，这些干扰素能够抑制巨噬细胞中的 HIV 复制。然而，另一项针对小鼠脑 CEC 培养物的研究表明，直接将细胞暴露于添加到管腔隔室的 LPS 中，会通过激活 p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）途径增加 HIV - 1 的跨细胞运输，这一过程可能由 GM - CSF 和 IL - 6 介导。
- 西尼罗河病毒（WNV）感染：WNV 是一种通过蚊子传播的 RNA 病毒，可导致部分易感人群（如老年人和免疫功能低下者）脑部感染，引发致命性脑炎。研究发现，野生型小鼠感染 WNV 后，全身的 TNF - α 和 IL - 6 水平会升高，而全身 Tlr3 基因敲除的小鼠这些细胞因子水平较低，且其外周的病毒载量高于野生型小鼠，但脑部病毒载量低于野生型小鼠，对致命感染和神经病理学的抵抗力更强。这表明 TLR3 在 WNV 进入大脑的过程中发挥作用，可能是通过跨内皮运输或感染的髓细胞在血脑屏障受损后渗入大脑。事实上，全身给予 WNV 或 Poly（I:C）会破坏野生型小鼠的血脑屏障完整性，但不会影响 Tlr3 基因敲除小鼠，且这种影响依赖于 TNF 受体 - 1 信号传导。
- SARS - CoV - 2 感染：严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS - CoV - 2）感染会导致血脑屏障破坏、血管损伤以及 CEC 功能障碍和死亡，还会引发神经系统和精神症状。虽然关于 SARS - CoV - 2 是否感染 CEC 和周细胞存在争议，但有研究表明，CEC 会对 SARS - CoV - 2 蛋白做出反应。例如，暴露于病毒来源的 S1 蛋白会降低紧密连接蛋白的表达，并诱导 IL - 6 等介质的释放，进而激活人类小胶质细胞系中的炎症途径。SARS - CoV - 2 来源的蛋白可作为 PAMPs 激活先天免疫细胞中的 TLR 信号传导，尽管目前对 CEC 和周细胞中表达的 TLRs 在 SARS - CoV - 2 感染后对神经炎症和神经损伤的具体贡献研究较少，但这一领域值得进一步深入研究。
- 炎性小体
- 炎性小体在 CEC 中的表达与功能：CEC 表达多种核苷酸结合和寡聚化结构域（NOD）样受体（NLRs），包括 NLRP1、NLRP3、NLRP5、NLRC4 和 NLRC5。氧化应激诱导剂、IFN - γ、IL - 1β 和 TNF - α 等会差异调节 CEC 中 NLRs 的表达。用 LPS 预处理 CEC 培养物，再用细菌胞壁酰二肽（MDP）激活 NLRP3，会上调经典炎性小体成分（如 NLRP3 和 caspase 1）的 mRNA 和蛋白质表达，并显著增加细胞裂解物和培养基中 IL - 1β 的含量，且这种增加呈 caspase 依赖性，这表明 NLRP3 炎性小体在 CEC 介导的炎症中通过促进 IL - 1β 释放发挥关键作用。非经典炎性小体途径在 CEC 中也会被激活，当 LPS 被导入 CEC 时，会被 caspase 11 识别，激活非经典炎性小体，导致 IL - 1β 释放，而且非经典炎性小体激活导致的 IL - 1β 释放比经典炎性小体激活时更强烈，同时还与 CEC 紧密连接的破坏有关。
- 炎性小体在周细胞和 CEC - 周细胞通讯中的作用：人类周细胞表达多种炎性小体成分，如 NLRP1 - 3、NLRP5、NLRP9、NLRP10、NLRC5 以及 caspase - 1、4、5 和 ASC。细胞因子和其他炎症信号刺激周细胞会增加 pro - Il - 1β 的表达，但不会诱导 IL - 1β 的释放，这表明经典炎性小体途径未被激活。然而，当将 LPS 导入周细胞，并同时用 IFN - γ 和 TNF - α 刺激时，会增加 pro - Il - 1β 的表达和 IL - 1β 的释放，说明周细胞通过激活非经典炎性小体来促进炎症反应。此外，炎性小体诱导的信号介导了 CEC - 周细胞通讯，周细胞在炎症细胞因子的影响下释放的效应物能够作用于 CEC，激活经典炎性小体，导致 IL - 1β 释放，而且激活非经典炎性小体的周细胞条件培养基对 CEC 的影响更为显著，会降低紧密连接蛋白的表达，表明炎症期间周细胞来源的信号会导致血脑屏障受损。
- 炎性小体在脑病理中的作用
- 中风：NLRP3 炎性小体激活与中风诱导的 CEC 功能损伤有关。对小鼠永生化脑内皮细胞系进行氧糖剥夺会导致细胞焦亡，用 NLRP3 炎性小体抑制剂（MCC950）处理可挽救细胞免于焦亡，同时减少裂解的 GSDMD，增加未裂解的 GSDMD，还能减轻脑内皮细胞系缺血后炎症趋化因子、细胞因子以及基质金属蛋白酶的释放。在体内实验中，使用小鼠 MCAO 模型发现，用 NLRP3 炎性小体抑制剂处理可减少病变体积和血脑屏障通透性，防止 CD - 31 阳性 CEC 死亡，增加未裂解的 GSDMD，表明焦亡减少。此外，CEC 表达的 G - 蛋白偶联受体 124（GPR124）在脑特异性血管生成和血脑屏障完整性中起关键作用，OGD 处理 bEnd.3 细胞系会使 GPR124 先升高后降低，过表达 GPR124 会上调 NLRP3、裂解的 caspase - 1、N - 末端 GSDMD 和 IL - 1β，导致细胞焦亡，而使用特异性抑制剂可减少细胞焦亡和梗死体积。
- 创伤性脑损伤：越来越多的证据表明，脑与免疫细胞之间的双向通讯可通过细胞外囊泡（EVs）进行，EVs 可通过胞吞作用双向穿过血脑屏障。从创伤性脑损伤患者血浆中分离出的 EVs（TEV）静脉注射到 TBI 小鼠体内后，会加剧脑水肿和血管渗漏，还会增加 CEC 中 ICAM1 的表达，导致 TEV 与内皮细胞的高粘附。同时，TEV 处理后，CEC 中裂解的 caspase - 1、NLRP3、ASC 和 GSDMD - N 末端上调，表明 CEC 发生焦亡，紧密连接蛋白下调，血脑屏障被破坏。即使在未受伤的小鼠中，注射 TEV 也会诱导 NLRP3/caspase - 1/GSDMD 依赖性的 CEC 焦亡，而高迁移率族蛋白 B1（HMGB1，一种在 TBI 患者血液和脑脊液中增加的 DAMP）在 TEV 的有害作用中起重要作用，用 HMGB1 抑制剂与 TEV 同时给药可减轻 CEC 病理。
四、研究结论与讨论
目前，CEC 作为血脑屏障的守门人，其免疫功能已得到广泛认可。大量证据表明，CEC 释放的炎症效应物会导致全身和神经炎症，许多研究也探讨了调节 CEC 功能（尤其是紧密连接和血脑屏障通透性）的炎症信号的影响。然而，先天免疫受体对 CEC 功能的贡献仍需进一步研究。虽然 TLR4 和 NLRP3 炎性小体是神经炎症研究中特征最明确、研究最频繁的先天免疫受体，在 CEC 研究中也比其他先天免疫受体更受关注，但要全面了解 CEC 的先天免疫功能，还需要对其他 TLRs、炎性小体和其他先天免疫受体进行更广泛的研究。深入探究 CEC 中不同先天免疫受体之间相互作用的机制，对于理解炎症性血脑屏障破坏至关重要。
此外，虽然 CEC 一直是血脑屏障 TLRs 和炎性小体研究的主要焦点，但周细胞在维持血脑屏障完整性和神经血管单元中的关键作用表明，周细胞的免疫功能以及先天免疫受体对其炎症反应的贡献是很有前景的研究领域。揭示先天免疫受体在神经血管单元细胞间相互作用中的作用，对于深入理解脑部疾病中血脑屏障受损机制至关重要，这将有助于确定潜在的治疗靶点，开发新的疗法，预防血脑屏障破坏，促进修复，保护大脑免受血脑屏障功能障碍在各种神经系统和精神疾病、中枢神经系统损伤和感染中带来的有害影响。这项研究为后续相关领域的研究指明了方向，具有重要的理论和实践意义。
