肿瘤来源外泌体 miR-205 经 PI3K/Akt/mTOR 通路驱动 M2 巨噬细胞极化促进卵巢癌进展的前沿研究

为解决卵巢癌（OC）中肿瘤细胞与免疫细胞相互作用机制不明的问题，中南大学 Liuqing He 等人开展肿瘤来源外泌体 miR - 205 对 OC 影响的研究，发现其可促进 M2 巨噬细胞极化推动 OC 进展，为 OC 治疗提供新靶点，值得科研人员阅读。

　　

中南大学湘雅二医院（Department of Pathology, The Second Xiangya Hospital, Central South University）的 Liuqing He 等人在《Journal of Ovarian Research》期刊上发表了题为 “Tumour-derived exosomal miR-205 promotes ovarian cancer cell progression through M2 macrophage polarization via the PI3K/Akt/mTOR pathway” 的论文。这篇论文在卵巢癌研究领域意义重大，为深入理解卵巢癌的发病机制以及开发新的治疗策略提供了关键线索。

研究概述

在这篇论文中，研究人员发现肿瘤来源的外泌体 miR - 205（一种微小核糖核酸）能够通过 PI3K/Akt/mTOR 信号通路（参与细胞生长、增殖、存活等多种重要过程的信号传导途径）促进 M2 巨噬细胞极化（巨噬细胞向具有特定功能的 M2 表型转变），进而推动卵巢癌细胞的进展。这一发现揭示了卵巢癌微环境中肿瘤细胞与免疫细胞相互作用的新机制，为卵巢癌的治疗提供了潜在的新靶点。

研究背景

卵巢癌（Ovarian Cancer，OC）是生殖系统中最致命的恶性妇科肿瘤，其肿瘤微环境（Tumour Microenvironment，TME）内存在着复杂的相互作用。肿瘤相关巨噬细胞（Tumour - Associated Macrophages，TAMs）是 TME 中的关键参与者，它们可极化为 M1 和 M2 两种不同表型。M1 巨噬细胞具有促炎特性，与抗肿瘤反应相关；而 M2 巨噬细胞往往具有免疫抑制功能，被认为有助于肿瘤的进展和转移 。

近年来，细胞间通过外泌体（Exosomes，一种由不同细胞类型释放的小细胞外囊泡）进行通信的研究备受关注。外泌体含有多种分子，包括 miRNAs、蛋白质和核酸等。癌细胞释放的外泌体 miRNAs 可以刺激巨噬细胞改变其表型，在促进癌症进展和转移中发挥作用。其中，miR - 205 在癌症生物学，尤其是卵巢癌中的作用逐渐受到重视，它参与调节癌细胞的多种细胞功能，如增殖、凋亡和迁移等。然而，TAMs 与 miRNAs 在 OC 中的复杂关系，特别是 miR - 205 在 TAM 极化中的具体作用机制，仍未完全明确。为了填补这些知识空白，研究人员开展了此项研究，旨在阐明肿瘤来源的外泌体 miR - 205 如何影响 TAM 极化以及肿瘤细胞的后续行为，为卵巢癌的治疗开辟新途径。

研究方法

1. 组织样本采集：从 2014 年至 2018 年，研究人员在中南大学湘雅医院病理科收集了 74 例福尔马林固定石蜡包埋样本，包括 34 例 OC 组织标本、20 例正常卵巢组织标本和 20 例转移组织标本。这些样本均来自未接受过放疗和化疗的 OC 患者，且所有标本诊断均经合格病理学家术后确认。该研究获得了湘雅医院伦理委员会的批准，并遵循赫尔辛基宣言的伦理准则，每位参与者都签署了知情同意书。
2. 细胞培养：实验选用上皮 OC 细胞系 HO - 8910 和单核细胞系 THP - 1，它们分别购自中国科学院细胞库、中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）和中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心（Cell Resource Center, IBMS, CAMS/PUMC，CRC/PUMC） 。研究团队构建了稳定过表达 miR - 205 的 HO - 8910 细胞系及阴性对照细胞系。所有细胞系均在添加 10% 胎牛血清（Foetal Bovine Serum，FBS）的 DMEM 或 RPMI 1640 培养基中培养。THP - 1 细胞则用 100 ng/ml 佛波酯（Phorbol 12 - myristate 13 - acetate，PMA）孵育 24 - 48 小时，诱导分化为巨噬细胞。在进行外泌体处理实验时，将 1 μg/ml 外泌体添加到受体细胞（2×10?）的培养基中。
3. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）和原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）：对 74 例石蜡包埋的 OC 组织进行 IHC 和 ISH 染色。使用抗 CD68（1:200）和抗 CD163（1:200）抗体检测巨噬细胞标记 CD68 和 M2 型巨噬细胞标记 CD163 的表达。采用 LNA microRNA ISH miR - 205 优化试剂盒对 OC 组织样本进行 ISH，以检测 miR - 205 的表达。染色后的切片经数字病理扫描设备扫描和拍照，通过 Image - Pro plus（IPP，version 5.0）分析获得的最终分数来确定 CD68、CD163 和 miR - 205 的相对表达水平，阳性率通过积分光密度（Integral Optical Density，IOD）/ 面积总和计算。
4. 外泌体分离与鉴定：将细胞系培养至 60 - 70% 汇合度后，更换为添加 10% 外泌体耗尽的 FBS 的新鲜培养基。48 小时后收集细胞培养基，依次经离心、过滤、透析等步骤，再与 ExoQuick - TC 外泌体沉淀溶液孵育，最终离心收获外泌体。通过蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析外泌体相关蛋白标记 Hsp70、CD63 和外泌体特异性标记 TSG101，利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察外泌体形态，使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒测量外泌体的含量。
5. 外泌体标记与追踪：使用 PKH67 红色荧光膜连接染料对纯化的外泌体进行标记，然后将其添加到未染色的巨噬细胞中进行摄取研究。处理 4 小时后，通过荧光显微镜检测细胞。
6. RNA 干扰、载体转染和定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）：使用 Lipofectamine 2000 试剂将 miR - 205 模拟物（10 nM）、抑制剂（20 nM）、阴性对照（10 nM）和 PTEN 表达质粒（2 μg）转染到细胞中。转染 24 - 48 小时后收集细胞进行进一步检测，通过荧光显微镜和 RT - PCR 分析验证转染效率。使用 TRIzol 试剂提取细胞和外泌体中的总 RNA，按照逆转录系统说明书合成互补 DNA，进行逆转录和 qRT - PCR，采用 ΔΔCt 法评估相对表达水平，用 2?ΔΔCt 法分析结果。
7. 质粒构建、瞬时转染和荧光素酶报告基因检测：从小鼠基因组 DNA 模板扩增 miR - 205 启动子（420 bp），插入 pGL3 载体。构建携带 miR - 205 靶位点的报告载体，将预测的 PTEN cDNA 靶位点合成 3' 非翻译区（3’ - untranslated region，UTR）片段插入 pMIR - REPORT 荧光素酶 miRNA 表达报告载体。在荧光素酶报告基因检测中，将 HO - 8910 细胞接种于 24 孔板，转染相应质粒，36 小时后收获细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统测量荧光素酶活性。
8. 共培养、细胞迁移和侵袭实验：将 THP - 1 细胞（1×10?）接种于 8-mm Transwell 小室底部，用 PMA（100 ng/ml）处理 48 小时使其分化为 M0 巨噬细胞，更换为含 10% FBS 的正常培养基 24 小时以消除 PMA 的影响。在共培养实验前，将肿瘤细胞（5×10?）接种于共培养系统上层。用 miR - 205 - Exos 或 miR - 205 模拟物 / 阴性对照 / 抑制剂处理 M0 巨噬细胞后，与 HO - 8910 细胞共培养，进行细胞迁移和侵袭实验。
9. 动物实验：所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）实验室动物护理和使用指南，并经中南大学动物护理和使用委员会批准。将 4 - 5 周龄、18 - 20 g 的雌性 BALB/c 裸鼠随机分为两组（每组 n = 6），分别腹腔注射用 NC - Exos 或 miR - 205 - Exos 预处理的条件巨噬细胞与 HO - 8910 细胞（1.5×10?细胞）的混合物。定期通过活体动物生物发光成像技术监测肿瘤生长情况。
10. 统计分析：所有实验均重复三次，数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示。使用 Student's t 检验或单因素方差分析（one - way ANOVA）分析处理组和对照组之间的差异。采用 Kaplan - Meier 法估计生存曲线，用 log - rank 检验计算曲线之间的差异。P 值小于 0.05 被认为具有统计学意义，使用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计分析。

研究结果

1. miR - 205 表达与 OC 患者 TAM 浸润相关：通过 IHC 检测发现，与正常组织相比，原发性肿瘤和转移性肿瘤中 CD163 的表达显著上调，且其高表达与 OC 患者预后不良相关。进一步研究发现，CD163 在 miR - 205 高表达的 OC 标本中表达更高，Spearman 相关性分析表明，CD163 表达增加时，miR - 205 也相应上调。此外，miR - 205 高表达的 OC 组织中，miR - 205 阳性免疫细胞浸润增加，经 ISH 和 IHC 检测，多数 OC 组织样本中肿瘤细胞以及 CD68?和 CD163?细胞均有 miR - 205 染色。由此推测，miR - 205 可能在巨噬细胞极化中发挥重要作用。
2. OC 细胞来源的外泌体通过转运 miR - 205 使巨噬细胞向 M2 表型极化：研究人员构建了稳定过表达 miR - 205 的 OC 细胞系 HO - 8910，分离出高 miR - 205 含量的外泌体（miR - 205 - Exos）和低 miR - 205 含量的外泌体（NC - Exos）。电镜观察显示外泌体呈典型的圆形颗粒，直径 30 - 100 nm，Western blot 分析证实了外泌体蛋白的存在。用 PKH67 标记 miR - 205 - Exos 后与巨噬细胞共孵育，发现其可被巨噬细胞内化，且巨噬细胞中 miR - 205 表达显著增加。进一步检测巨噬细胞的免疫表型和细胞因子谱发现，与 NC - Exos 或对照组相比，miR - 205 - Exos 处理的巨噬细胞中 M2 细胞因子（CD163、IL - 10 和 CCL18）表达显著增加，M1 细胞因子（IL - 1β 和 TNF - α）表达显著降低，表明外泌体 miR - 205 可促进巨噬细胞向 M2 表型分化。
3. 肿瘤来源的外泌体 miR - 205 通过改变 M2 样巨噬细胞极化促进 OC 细胞迁移和侵袭：建立共培养系统，研究外泌体 miR - 205 诱导的 M2 巨噬细胞对 OC 细胞迁移、侵袭和上皮 - 间质转化（Epithelial - Mesenchymal Transition，EMT）的影响。转染 miR - 205 模拟物或抑制剂后，分别上调或下调 OC 细胞中 miR - 205 的表达。结果显示，与 NC - Exos 处理的巨噬细胞相比，miR - 205 - Exo 处理的巨噬细胞显著增强了 OC 细胞的迁移和侵袭能力；下调巨噬细胞中 miR - 205 的表达则削弱了细胞迁移和侵袭能力。此外，共培养实验表明，外泌体 miR - 205 诱导的 M2 巨噬细胞可使 OC 细胞中上皮细胞标记物 E - cadherin 表达降低，间质细胞标记物 vimentin 和 MMP7 表达增加，miR - 205 模拟物组也得到相同结果，且该效应可被 miR - 205 抑制剂逆转，说明外泌体 miR - 205 诱导的 M2 巨噬细胞可增强 OC 细胞的迁移、侵袭和 EMT。
4. 外泌体 miR - 205 诱导的 M2 巨噬细胞促进 OC 体内发展：在动物实验中，用 NC - Exos 或 miR - 205 - Exos 预处理巨噬细胞 48 小时，然后将其与荧光素酶标记的 HO - 8910 细胞混合，注射到裸鼠腹腔。结果显示，与 NC - Exo 组相比，miR - 205 - Exo 组小鼠腹腔内荧光素酶活性水平显著增加，尤其是在首次注射后 3 - 4 周；miR - 205 - Exo 组小鼠腹腔内植入瘤数量更多，生存时间更短。IHC 和 HE 染色表明，miR - 205 - Exo 组中 M2 型巨噬细胞标记物 CD163 的表达显著增加，即更多 M2 巨噬细胞浸润到癌组织中，表明外泌体 miR - 205 在肿瘤微环境中诱导巨噬细胞向 M2 型极化，促进肿瘤在体内的进展。
5. 外泌体 miR - 205 通过激活 PI3K/AKT/mTOR 轴极化 M2 巨噬细胞：利用 TargetScan 和 miRBase 预测 miR - 205 的靶基因，选择 PTEN 进行研究。荧光素酶报告基因检测证实 miR - 205 对 PTEN 有直接抑制作用。miR - 205 模拟物或 miR - 205 - Exos 显著降低巨噬细胞中 PTEN 的 mRNA 和蛋白水平，而 miR - 205 抑制剂则起相反作用。转染 PTEN 质粒可挽救被 miR - 205 或 miR - 205 - Exos 抑制的 PTEN 表达。进一步研究发现，过表达 miR - 205 可显著增加 M2 型标记物（CD163 和 IL - 10）的表达，降低 M1 型标记物（IL - 1β 和 TNF - α）的表达，该效应可被 PTEN 表达逆转。此外，miR - 205 模拟物或 miR - 205 - Exos 处理导致巨噬细胞中 PTEN 表达降低，p - AKT、p - mTOR 和 p - 4EBP - 1 表达增加，且该效应可被 PTEN 表达逆转。使用 PI3K 抑制剂 GDC - 0941、AKT 抑制剂 MK - 2206 和 mTOR 抑制剂雷帕霉素（rapamycin）阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号通路后，miR - 205 过表达对 M2 巨噬细胞极化的促进作用被显著消除，表明外泌体 miR - 205 通过下调巨噬细胞中 PTEN 的表达，激活 PI3K/AKT/mTOR 轴，诱导巨噬细胞向 M2 表型极化。

研究结论与讨论

本研究揭示了卵巢癌微环境中 miR - 205 通过细胞外囊泡调节巨噬细胞极化的分子机制。肿瘤来源的外泌体 miR - 205 可诱导巨噬细胞向 M2 表型极化，进而促进卵巢癌细胞的进展，这一过程通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路实现。这一发现强调了 miR - 205 在肿瘤进展中的关键作用，突出了其作为卵巢癌治疗潜在靶点的可能性。

随着临床免疫疗法的广泛应用，卵巢癌免疫微环境的调节受到越来越多的关注。TAMs 在卵巢癌的进展和转移中起着关键作用，而癌细胞与巨噬细胞之间的通信可由外泌体介导，外泌体 miRNAs 能够重塑肿瘤微环境，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究聚焦于 miR - 205 在卵巢癌微环境中对 TAM 极化的调控作用，为理解肿瘤细胞与免疫细胞之间的动态相互作用提供了新的视角，为开发卵巢癌的创新治疗策略奠定了基础。

然而，该研究也存在一些局限性。样本量相对较小，可能无法充分代表卵巢癌患者群体的异质性，限制了研究结果的普遍性；缺乏全面的临床验证，难以对 miR - 205 作为治疗靶点的转化潜力得出可靠结论；对不同巨噬细胞亚型的功能差异研究不够深入，可能影响对肿瘤微环境中巨噬细胞作用的全面理解；数据分析过程中可能存在的批次效应也会影响结果的可靠性。未来的研究需要解决这些问题，以提高研究结果的有效性和适用性。

总的来说，这项研究为卵巢癌的研究开辟了新的方向，持续探索 miR - 205 及其调节通路有望为卵巢癌患者带来更好的治疗效果，同时也将推动癌症免疫生物学的深入发展。