木豆 REM 基因家族的深度解析 —— 揭示 CcREM1 和 CcREM6 基因在热胁迫响应中的关键作用

为解决木豆应对热胁迫及产量提升问题，河南大学研究人员开展木豆 REM 基因研究。鉴定出 17 个基因，发现其参与热胁迫响应。该研究为培育耐热木豆品种提供依据，极具科研价值，推荐关注。

　　

河南大学（School of Life Sciences, Henan University）的研究人员 Aimen Shafique 等人在《BMC Plant Biology》期刊上发表了题为 “Molecular characterization of REM genes in Cajanus cajan suggests the role of CcREM1 and CcREM6 like genes in heat stress response” 的论文。该研究对于深入了解木豆（Cajanus cajan）应对热胁迫的分子机制，以及推动木豆遗传育种、保障全球粮食安全有着重要意义。

研究背景

在全球气候变化的大背景下，气温不断攀升，这对植物的生长发育构成了严重威胁。高温会扰乱植物体内众多生化和生理进程，最终导致农作物减产。木豆作为世界第六大重要的豆科作物，富含蛋白质，在亚洲和非洲地区，是当地贫困农民重要的经济作物。然而，随着环境变化，提高木豆的产量和营养平衡迫在眉睫。

Remorin（REM）蛋白是一类定位于植物质膜的蛋白，此前的研究发现，它在植物应对多种生物和非生物胁迫时发挥着关键作用，比如参与调控热胁迫耐受性，通过稳定膜完整性、与信号组件相互作用，激活包括热休克蛋白（HSPs）调控在内的应激反应途径，帮助植物维持细胞稳定 。但在木豆中，REM 基因尚未得到深入研究。同时，高温会直接影响植物细胞内活性氧（ROS）的积累，ROS 积累与清除的失衡会导致细胞死亡。已有研究表明，过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶参与调节植物在热胁迫下的 ROS 产生。鉴于木豆的重要经济价值和面临的高温威胁，开展对木豆 REM 基因的研究显得尤为必要。

研究方法

1. REM 基因家族的鉴定与生物信息学分析：研究人员从 TAIR-A. thaliana 数据库获取拟南芥（Arabidopsis thaliana）REM 家族成员的蛋白质序列，以此为查询序列，在木豆蛋白质组（C.cajan_V1.1）中进行 blastP 程序搜索，识别木豆中潜在的 REM 基因家族成员（e<1e-5 且 50% 同一性） 。之后进行反向 blast，利用 Pfam、SMART 和 NCBI-CDD 数据库验证基因是否存在 REM 特异性结构域，去除无特异性结构域的成员。通过 NCBI 基因数据库检索基因相关信息，利用 Protparam 工具分析蛋白质特征，借助 DeepLoc-2.0 预测蛋白质亚细胞定位。

2. 系统发育和基因结构分析：运用 Clustal-Omega 对木豆和拟南芥的 REM 家族成员氨基酸序列进行多序列比对，使用 MEGA-11.0.13 软件，通过最大似然法构建系统发育树。从 NCBI 获取拟南芥和木豆 REM 家族成员的编码和基因组序列，在 GSDS 服务器上分析基因结构。此外，从 NCBI 获取水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的 REM 家族成员蛋白质序列，进行多序列比对和系统发育树构建。

3. 启动子分析和染色体定位：提取木豆 REM 家族所有推定成员上游 1000bp 的序列，在 PlantCare 数据库中鉴定植物保守的顺式作用元件。从 NCBI-gene 数据库获取木豆 REM 家族成员的基因特征，利用 TB-tools 软件绘制基因在染色体上的定位图和启动子区域顺式元件的图形。

4. 植物材料处理与胁迫施加：选取野生型木豆种子，播种在装有泥炭藓的小塑料盆中，置于温度、湿度可控的培养箱内培养。待植株生长两周后，选取 30 盆健康植株分为 5 组，每组 6 个重复，其中 3 个作为对照，3 个作为处理组。将处理组培养箱温度调整到 35°C，在 0min、30min、1h、2h 和 4h 时采集叶片样本，迅速冷冻于液氮中并保存于 - 80°C，用于后续分析。

5. 表达谱分析：基于 RNA 测序和 qRT-PCR 对木豆 REM 基因家族进行表达谱分析。从 NCBI-SRA 数据库下载已报道的 RNA 序列，利用生物项目编号进行组织特异性表达检测和热胁迫下差异表达分析。对 RNA 测序数据进行质量验证后，用 bowtie2 工具与参考基因组比对，cufflinks 程序计数读数，TB-tools 构建热图。使用 RNAprep Pure Plant Kit 提取样本 RNA，经反转录后，设计基因特异性引物进行 qRT-PCR，以管家基因 CcGAPDH 进行数据计算和标准化。

6. 热胁迫下的生化研究和 3D 蛋白质结构预测：测定热胁迫下不同处理组（0h 对照、3h 轻度胁迫、12h 重度胁迫）叶片中 POD、SOD 和 CAT 的活性。将木豆 REM 家族所有成员的蛋白质序列提交至 AlphaFold2 预测三维蛋白质结构，通过 SAVES 服务器的 Ramachandran Plot 和 ERRAT 测试分数验证结构质量，使用 Chimera X 程序可视化 3D 模型结构。

7. 统计分析：运用 Microsoft Excel 2021 对重复数据进行分析，计算均值和标准误差。借助 SPSS 程序进行最小显著差异检验（LSD）和成对 t 检验，p 值小于 0.05 和 0.01 分别表示差异显著（*）和极显著（**）。

研究结果

1. 木豆 REM 基因的鉴定和比较系统发育研究：通过一系列严谨的筛选和验证，研究人员在木豆基因组中成功鉴定出 17 个 REM 蛋白编码基因。基于与拟南芥中同源基因的相似性，对这些基因进行了重命名和分类。系统发育分析表明，木豆 REM 家族成员可分为 6 个亚组。不同亚组的成员之间存在着不同的进化关系，比如 CcREM1.1 和 CcREM1.2 是旁系同源关系，序列相似性达 82%，它们与拟南芥和蒺藜苜蓿中的对应基因存在共直系同源关系 。

2. 保守结构域和蛋白质编码基因特征分析：对木豆 REM 基因编码的蛋白质特征分析发现，不同亚组蛋白质的分子量、等电点存在差异。例如，CcREM1-like 蛋白的分子量在 20523.61 - 22931.62 之间，等电点为 5.4 - 9.07。所有 REM 蛋白的不稳定指数在 43.27 - 71.41 之间，均表现为不稳定，GRAVY 评分在?1.153 到 -0.698 之间 。亚细胞定位预测显示，所有蛋白均定位于细胞膜，部分蛋白（CcREM4.1、CcREM4.2 等）还定位于细胞质。此外，木豆和拟南芥的 REM 家族成员都存在高度保守的结构域，如 Remorin-C（ID PF03763）、Remorin-N（ID PF03766）和 PTZ00121 超家族结构域，但不同亚组的结构域分布存在差异。

3. 木豆 REM 基因的基因结构和系统发育分析：基于蛋白质序列构建的系统发育树进一步确认了 REM 家族成员分为 6 个组。基因结构分析发现，木豆 REM 基因在不同亚组内具有保守的内含子 / 外显子数量。例如，REM1-like 家族成员都含有 5 个外显子和 4 个内含子，REM2-like 家族的 CcREM2 含有 6 个外显子和 5 个内含子，而 REM5-like 家族成员的内含子和外显子数量和长度则存在变化。

4. 启动子分析和染色体定位：木豆 REM 基因在染色体上呈不均匀分布。部分染色体如 chr1、chr 2、chr 7 和 chr 9 各含 1 个 REM 基因，chr 3 和 chr 11 各含 2 个，chr 6 含有 3 个，还有一些基因位于支架区域。启动子分析发现，REM 基因的启动子区域存在 74 种不同类型（共 1512 个）的顺式作用元件，可分为核心元件、激素响应元件和胁迫响应元件。其中，核心元件包括 TATA-box（624 个）、CAAT-box（290 个）等；激素响应元件有 ABRE、CGTCA-motif 等；胁迫响应元件包含 Box-4、G-box 等，这些元件暗示了 REM 基因在转录调控，尤其是应对非生物胁迫中的潜在作用。

5. 基于 RNA 测序的表达谱分析和热胁迫下的生化测定：RNA 测序分析显示，木豆 REM 基因存在组织特异性表达。在叶片中，CcREM1.1、CcREM1.2 等基因显著表达，而 CcREM2、CcREM5.1 等基因不表达；在花中，CcREM1.1、CcREM1.2 等多个基因表达，部分基因如 CcREM2、CcREM6.3 等不表达 。热胁迫处理后，不同时间点 REM 基因的表达存在差异。30min 时，CcREM1.3 和 CcREM4.2 上调，其余多数基因下调；3h 时，CcREM1.3、CcREM4.2 和 CcREM6.7a 上调，部分基因下调，还有一些基因表达无变化。生化测定表明，热胁迫下 POD 和 SOD 活性显著增加，CAT 活性无明显变化。

6. 实时 RT-qPCR 表达验证：为进一步验证 REM 基因在热胁迫下的表达模式，研究人员选取 14 个基因进行 qRT-PCR 验证。结果显示，CcREM1-like 基因中，CcREM1.1 下调，CcREM1.3 上调，CcREM1.2 在处理后期下调；CcREM4-like 基因中，CcREM4.1 在 1h 和 4h 时下调，CcREM4.2 无明显变化；CcREM5-like 基因中，CcREM5.2 仅在 4h 时显著下调；CcREM6-like 基因中，CcREM6.1 和 CcREM6.5 在各处理阶段均显著下调。

研究结论与讨论

这项研究首次对木豆中的 REM 基因进行了全面的基因组分析，鉴定出 17 个 REM 基因同源物，揭示了它们的基因组组织、系统发育关系、结构特征以及在热胁迫响应中的功能意义。基因复制事件可能是木豆基因组中存在同源基因的原因，这些基因在进化过程中发生了分化，以适应特定的胁迫反应。

木豆 REM 基因在进化上具有保守性，其 C 末端卷曲螺旋结构域高度保守，而 N 末端区域的差异则暗示了功能的多样化。系统发育分类将 CcREM 基因分为 6 个不同的组，这与其他作物中 REM 基因家族的分类结果一致，凸显了 REM 基因在维持细胞完整性和应对环境胁迫方面的重要功能 。基因结构分析发现，同一亚组内的 CcREM 基因具有保守的外显子 - 内含子组织形式。

表达谱分析表明，多个 CcREM 基因呈现出组织特异性和胁迫响应性的表达模式。其中，CcREM1.3 在热胁迫下显著上调，可能在减轻热诱导的细胞损伤中发挥重要作用；CcREM6-like 基因的差异表达也显示出它们参与热胁迫响应的过程。启动子分析发现的顺式调控元件，进一步说明了 CcREM 基因在胁迫响应中的调控潜力，并且暗示它们可能参与激素介导的胁迫适应过程。

热胁迫下抗氧化酶（POD 和 SOD）活性的增加，表明 CcREM 基因可能参与调节 ROS 水平，维持细胞内的氧化还原平衡。这一发现与其他植物中 REM 基因的功能研究结果相似，进一步证实了 REM 基因在植物应对非生物胁迫中的重要作用。

研究鉴定出的热响应基因，如 CcREM1.3 和 CcREM6.5，为培育耐热木豆品种提供了潜在的靶点。借助基因编辑技术，如 CRISPR-Cas9，可以对这些基因进行功能验证和靶向操作，有助于推动木豆遗传育种工作。此外，研究还提供了 CcREM 蛋白的预测三维结构，其保守的卷曲螺旋结构域对于研究蛋白在质膜定位和与其他信号蛋白的相互作用具有重要意义。

未来的研究可以整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学方法，深入探究 REM 基因的调控网络。进一步研究蛋白质 - 蛋白质相互作用和翻译后修饰，将有助于更全面地阐明 REM 基因在植物应对非生物胁迫中的作用机制。将 REM 基因在模式植物中的研究成果应用于木豆等豆科作物，有望为应对气候变化下的可持续农业发展提供有力支持。