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为解决精准绘制遗传相互作用（GIs）图谱的难题，马丁路德大学哈勒 - 维滕贝格分校的研究人员评估 Cas13d 用于 GI 图谱绘制的效用。结果显示其优势明显，还克服了应用障碍。该研究对理解药物反应通路意义重大，强烈推荐科研人员阅读。
评估 Cas13d 作为遗传相互作用图谱绘制工具的效能
绘制遗传相互作用（GIs）图谱对于理解遗传网络的复杂性至关重要。在本研究中，马丁路德大学哈勒 - 维滕贝格分校哈勒医学院（Universit?tsmedizin Halle, Martin Luther University Halle-Wittenberg）的研究人员探究了靶向 RNA 的 CRISPR 系统 Cas13d 在 GI 图谱绘制中的效用，并将其与常用于 GI 图谱绘制的两种 DNA 核酸酶 Cas9 和 Cas12a 进行了比较。研究人员发现，与 Cas9 或 Cas12a 相比，Cas13d 能更快地诱导靶基因扰动，并且在产生双扰动时可使细胞群体更加均一。随后，研究人员在将靶向不同基因的向导 RNA（gRNAs）串联成一个 gRNA 阵列时，遇到了 Cas13d gRNA - gRNA 干扰问题，不过他们通过双启动子 gRNA 表达策略克服了这一问题。此外，通过将靶向同一基因的三个 gRNAs 串联成一个阵列，研究人员能够最大化 Cas13d 介导的基因敲低效应。结合这些策略，在减少文库规模的同时增强了增殖表型，有助于对致癌信号通路中的 GIs 进行可重复性定量分析。该研究凸显了 Cas13d 在 GI 图谱绘制方面的潜力，有望推动对与治疗相关的药物反应通路的理解。
理解错综复杂的遗传相互作用网络，对于揭示细胞系统的复杂性、解析疾病机制以及识别新型治疗靶点至关重要。为此，遗传相互作用（GI）图谱绘制已被证明是研究基因之间功能关系的有力手段。
GI 图谱绘制涉及在同一细胞中对基因进行成对扰动，然后对由此产生的功能丧失表型进行量化，以阐明一个基因如何调节另一个基因的表型。最初，GI 图谱绘制仅限于模式生物，如酵母，因为在技术上无法对人类细胞中的基因进行扰动。随着 RNA 干扰（RNAi）技术的出现，这种情况发生了改变，使得在人类细胞中进行 GI 图谱绘制成为可能，尽管 RNAi 存在脱靶效应等显著局限性。在过去十年中，更精确的基于 CRISPR 的方法几乎完全取代了 RNAi，成为 GI 图谱绘制的工具。尤其是酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9 核酸酶，以及在较小程度上酸胺球菌属（Acidaminococcus sp.）的 Cas12a（Cpf1）核酸酶、两者的组合，还有其他直系同源 CRISPR/Cas9 系统的组合，都已被用于在人类细胞中绘制 GIs 图谱。
近年来，RNA 靶向 CRISPR 效应蛋白（如 Cas13）的发展，拓展了遗传扰动实验的工具库。特别是来自黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）的 Cas13d，作为一种 VI - D 型 CRISPR - Cas 系统，它为可编程转录干扰提供了一个通用平台，能够在 RNA 水平上精确、高效地调控基因表达。此后，多项研究展示了 Cas13d 在针对编码及非编码转录本的遗传筛选、组合 Perturb - seq 筛选，以及原代人类 T 细胞的多重转录组调控中的应用。然而，迄今为止，尚无研究探索 Cas13d 在定量 GI 图谱绘制中的效用。
为适用于 GI 图谱绘制，CRISPR 系统必须能够在同一细胞中特异性、均一地扰动两个基因，以产生均一的双扰动细胞群体。靶向 DNA 的 CRISPR 酶 Cas9 和 Cas12a 通过在靶位点引入 DNA 双链断裂，随后由细胞内源性 DNA 损伤修复机制（如经典非同源末端连接（cNHEJ）、微同源介导的末端连接（MMEJ）和单链退火（SSA））进行修复，从而对靶位点进行遗传扰动。这些修复过程容易出错，因此常常在靶位点导致多种插入缺失（INDEL）突变，产生具有不同读码框和移码突变的遗传多样性细胞群体。另一方面，靶向 RNA 的 Cas13d 系统不依赖于细胞 DNA 修复途径，因为它作用于 RNA 转录本，因此应能在整个细胞群体中使靶转录本水平均一地降低。
CRISPR 系统适用于 GI 图谱绘制的另一个前提条件是，在同一细胞中靶向两个不同基因的向导 RNA（gRNAs）之间不存在序列特异性干扰。这一点非常重要，因为如果一个 gRNA 的活性因第二个 gRNA 的序列而异，那么定量计算 GI 评分（定义为双扰动测量表型与根据每个基因的单个扰动测量表型计算出的预期表型之间的偏差）就变得不可能。在这种情况下，需要指出的是，与 Cas9 不同，Cas12a 和 Cas13d 都可以加工自身的 gRNA 阵列，这意味着使用这些系统可以从同一启动子表达靶向不同基因的多个串联 gRNA 阵列。先前的研究已证明 Cas12a gRNA 阵列在 GI 图谱绘制中的适用性。虽然已有研究使用 Cas13d gRNA 阵列进行多重基因扰动，但尚未对 Cas13d gRNA 阵列在 GI 图谱绘制中的适用性进行评估。
在此，马丁路德大学哈勒 - 维滕贝格分校哈勒医学院的研究人员着手探索 Cas13d 在 GI 图谱绘制中的效用。研究人员证明，Cas13d 比 Cas9 或 Cas12a 分别更快、更均一地诱导遗传扰动，从而产生高度均一的双扰动细胞群体。此外，研究结果表明，将 Cas13d gRNAs 串联在一个阵列中，可能会导致一个 gRNA 的活性受到第二个 gRNA 序列的调节。这表明，将靶向不同基因的 Cas13d gRNAs 串联在一个阵列中，并不适用于 GI 图谱绘制的定量分析。为解决这一问题，研究人员表明，从不同启动子表达单个 gRNAs 可消除序列特异性干扰。此外，研究人员发现，将靶向同一基因的三个 Cas13d gRNAs 串联在一个阵列中，可增强靶基因敲低的效果，放大增殖表型，同时最小化文库规模。最后，研究人员使用单 gRNAs 或由两个启动子表达的单基因阵列，进行了一系列 GI 筛选，以系统地绘制六个调节慢性髓性白血病细胞系 K562 对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼反应的基因之间的 GIs 图谱。研究人员观察到，与单 gRNAs 相比，单基因阵列的 GI 评分效应值总体更大。研究人员发现，GI 评分不仅在每种方法内部具有可重复性，而且在单 gRNA 和单阵列筛选之间也具有良好的相关性。总之，研究人员成功建立并验证了两种 Cas13d 方法，用于定量分析与治疗相关的致癌信号通路中基因之间的相互作用。
结果
Cas9、Cas12a 和 Cas13d 的单基因扰动特性
与靶向 DNA 的核酸酶 Cas9 和 Cas12a 不同，核糖核酸酶 Cas13d 靶向 RNA 进行降解（图 1A）。因此，这些核酸酶扰动靶标的机制存在根本差异，Cas9 和 Cas12a 依赖于通过内源性 DNA 双链断裂修复途径引入移码突变，而 Cas13d 则自主降解其 RNA 靶标。为分析这些差异如何影响单扰动和双扰动的效果，研究人员比较了这三种系统之间的扰动动力学。为此，研究人员通过慢病毒转导，以低感染复数（MOI < 0.3）将三种 CRISPR 系统的组件导入慢性髓性白血病细胞系 K562。
图 1B 中的示例直方图说明了 Cas13d 比靶向 DNA 的核酸酶 Cas9 和 Cas12a 更快、更均一地降低 CD46 蛋白水平。这些差异源于靶向 DNA 与靶向 RNA 的 CRISPR 系统的不同作用机制。Cas9 和 Cas12a 介导的基因敲除结果中，DNA 双链断裂修复结果的近乎随机性质，导致细胞群体呈现双峰分布，即具有无效突变的细胞和 CD46 野生型水平的细胞。另一方面，由于其 RNA 降解作用机制，Cas13d 在 gRNA 转导后三天内，就产生了 CD46 水平降低的均一细胞群体（图 1B）。
接下来，研究人员用 Cas9、Cas12a 和 Cas13d 靶向细胞表面标记 CD46、CD47、CD63 和 CD71，然后通过流式细胞术随时间定量分析靶蛋白水平（图 1C）。转导三天后，两种靶向 DNA 的核酸酶几乎都未观察到靶蛋白水平降低，而 Cas13d 则显示出几乎完全的敲低。Cas9 和 Cas12a 核酸酶在转导后第 5 天或第 7 天达到最大靶蛋白降低水平，具体取决于靶标。综上所述，这些结果表明，Cas13d 比 Cas9 或 Cas12a 能更快地降低靶蛋白水平。
对于必需基因 CD71（K562 DepMap Chronos 评分： - 0.975），Cas9 和 Cas12a 介导的基因敲除分别在第 7 天或第 10 天显示出编辑细胞群体的减少。另一方面，Cas13d 在整个实验过程中产生了 79% - 87% 的稳定敲低。这些观察结果表明，Cas9 和 Cas12a 对 CD71 的完全缺失会损害 K562 细胞的存活，而 CD71 水平降低超过 80% 则不会。因此，“微调” 的 Cas13d 敲低可能有助于研究那些完全缺失会产生细胞毒性的基因的功能。
Cas9、Cas12a 和 Cas13d 的双基因扰动特性
当每个细胞中扰动的基因超过一个时（这是 GI 图谱绘制所必需的），上述三种 CRISPR 系统在靶基因扰动模式上的差异尤为重要。图 1D 展示了所有三种测试的 CRISPR 系统在单基因或双基因扰动后的细胞分布情况。在 Cas9 和 Cas12a 双扰动的情况下，仍然存在未扰动、单扰动和双扰动细胞群体的混合，而在 Cas13d 的情况下，整个细胞群体均匀地向双阴性转变（图 1D）。Cas9、Cas12a 和 Cas13d 的双扰动细胞群体分别为 51.2% ±5、81.6% ±0.7 和 95.4% ±0.9（图 1E）。综上所述，这些结果表明，Cas13d 不仅比两种靶向 DNA 的 CRISPR 系统能更快地产生基因扰动，而且能产生最均一的双扰动细胞群体，使其成为 GI 图谱绘制的有前景的工具。
串联的 Cas13d gRNAs 表现出序列依赖性干扰
Cas13d 能够将多个 gRNAs 的串联体（称为 gRNA 阵列）加工成有功能的单个 gRNAs。在此，研究人员想要评估 Cas13d gRNA 阵列在 GI 图谱绘制中的效用，这需要对增殖值（tau）进行量化，以计算 GI 评分。两个基因之间的 GI 评分，计算为同一细胞中两个基因扰动的测量表型与根据每个基因单独的扰动测量表型计算出的预期表型之间的偏差。因此，无论在同一阵列中表达的第二个 gRNA 的序列如何，两个 gRNAs 都必须对其靶 RNA 发挥相同的作用。
为确定 Cas13d 阵列是否如此，研究人员针对六个基因设计了 gRNAs，这些基因参与慢性髓性白血病细胞系 K562 对伊马替尼的反应，此前研究人员已确定了它们的作用。K562 细胞携带 9 号和 22 号染色体之间的易位，产生了 BCR::ABL 融合癌基因，这是一种持续激活的酪氨酸激酶，导致细胞不受控制地分裂。应用 BCR::ABL 抑制剂（如伊马替尼），彻底改变了慢性髓性白血病的治疗方式。研究人员选择了三个扰动后使 K562 细胞对伊马替尼治疗敏感的基因，即伊马替尼的直接靶点（BCR） - ABL1、GAB2 和 SOS1，以及三个扰动后使细胞对伊马替尼敏感性降低的基因，即 PTPN1、NF1 和 SPRED2。研究人员根据先前描述的 Cas13d gRNA 设计规则，为每个靶基因设计了 27 个 gRNAs（补充数据 1）。如 图 2A 所述，双 gRNA 阵列文库用于混合 CRISPR 筛选。文库的克隆方式是，两个串联的 gRNAs 由单个小鼠 U6（mU6）启动子表达（图 2B）。每个双 gRNA 阵列要么在位置 1 靶向一个基因，与位置 2 的 30 个不同非靶向对照 gRNAs（gNTC）之一组合（U6 - gRNA - gNTC），要么反之（U6 - gNTC - gRNA）。伊马替尼处理的技术筛选重复实验中 tau 值之间的相关性很高（r = 0.79），证实了筛选结果的技术可重复性（图 2C，补充图 1A - E）。有趣的是，比较同一 gRNA 在阵列两个位置的 tau 值，即 gRNA - gNTC（位置 1）和 gNTC - gRNA（位置 2），发现两个位置之间的相关性模式存在差异，这表明同一 gRNA 在不同位置的性能存在差异（图 2D，补充图 1F，补充数据 2）。为进一步探究这一问题，研究人员选择了针对 PTPN1 和 SOS1 表现最佳的三个 gRNAs，并根据它们在 gRNA 阵列位置 1 与 30 个不同 gNTC 组合时的性能进行排序（图 2E，上图）。研究人员观察到，同一 gRNA 的 tau 值存在很大差异，这取决于它们在位置 2 与哪个 gNTC 序列串联。例如，与所有六个选定 gRNAs 与 gNTC - 28 串联时，产生了很强的正（gPTPN1）或负（gSOS1）tau 值，而相同的 gRNAs 与 gNTC21 串联时，仅产生了最小的细胞富集或耗竭。在相反的方向（gNTC - gRNA）则未观察到这种趋势（图 2E，下图）。为获得更系统的概述，研究人员测定了在位置 1（补充图 2B）或位置 2（补充图 2C）表达的靶向基因 gRNAs 与相应另一位置的 30 个不同 gNTC 组合时的 tau 值。与图 2E 所示结果类似，位置 1 中针对靶基因的特定 gRNAs 的 tau 值效应大小，以 gNTC 序列特异性方式变化，而当靶向基因的 gRNA 在位置 2 表达时，则未观察到这种效应。位置 1 中不同靶向基因 gRNAs 的阵列之间的强正相关和负相关，进一步证明了靶向基因 gRNAs 之间存在系统性的 gRNA - gRNA 干扰（补充图 2D）。在位置 2 表达的靶向基因 gRNAs 之间不存在系统性相关性，这表明 gRNA - gRNA 干扰仅在靶向基因的 gRNA 在位置 1 表达时发生，而在位置 2 表达时则不会，这可能是由于 RfxCas13d 加工 gRNA 阵列的方式所致。综上所述，这些结果表明，由于同一阵列中 gRNAs 之间的序列依赖性干扰，串联针对不同靶基因的 Cas13d gRNAs，不是定量 GI 图谱绘制方法的可行选择。
从单独启动子表达 gRNA 可防止 gRNA - gRNA 干扰
为克服串联 gRNAs 时观察到的 gRNA - gRNA 干扰，研究人员实施了一种改进的 gRNA 表达策略，即每个 gRNA 由单独的启动子表达。为防止文库克隆过程中的重组，研究人员使用小鼠 U6 启动子（mU6）驱动 gRNA - 1 的表达，使用人类 U6 启动子（hU6）驱动 gRNA - 2 的表达（图 2F）。使用这种设置，研究人员克隆了一个混合文库，针对与之前相同的六个基因，每个基因由 27 个 gRNAs 靶向，这些 gRNAs 要么由 mU6 启动子（位置 1）表达，要么由 hU6 启动子（位置 2）表达（补充数据 1）。该文库在图 2A 所述的相同条件下用于混合筛选。伊马替尼处理的技术筛选重复实验中 tau 值之间的相关性很高（r = 0.91），表明筛选数据具有可重复性（图 2G，补充图 3A - E）。
比较在两个位置表达的靶向基因 gRNAs 的相关性，发现相关性同样高达 0.92（图 2H，补充图 3F，补充数据 2），这表明靶向基因 gRNA 的性能与其表达位置无关。就像在串联设置（U6 - g1 - g2）中一样，研究人员鉴定出了针对所有六个靶基因的活性 gRNAs。然而，在双启动子设置（U6 - g1 - U6 - g2）中，无论共表达的 gNTC 序列如何，活性 gRNAs 在两个位置观察到的表型都保持一致（补充图 2F，G）。此外，不同靶向基因 gRNAs 之间未观察到 gNTC 序列特异性的性能差异（补充图 2H），这表明从单独启动子表达两个 gRNAs 可以克服上述串联 gRNAs 中观察到的 gRNA - gRNA 干扰。这些发现表明，Cas13d 在 GI 图谱绘制中具有普遍适用性。
单基因阵列产生更强的敲低和增殖表型
虽然 gRNA - gRNA 干扰排除了使用针对两个不同靶基因的 Cas13d 阵列进行 GI 图谱绘制的可能性，但串联针对同一靶基因的多个 gRNAs，仍可能是实现更强靶基因敲低的可行选择。为验证这一假设，研究人员将针对同一靶基因的三个 gRNAs 串联成一个阵列，称为 “单基因阵列”（图 2I）。然后，研究人员通过靶向相同的细胞表面标记 CD46、CD47、CD71 和 CD63，将单基因阵列的敲低效果与三个单 gRNAs 各自的效果进行比较（补充数据 3）。单基因阵列始终显示出比任何一个单 gRNA 更强的敲低效果，CD46、CD47、CD71 和 CD63 的残留靶蛋白表达分别低至 0.7%、4.
