角鲨烯：茶树间双向通信的关键反馈信号分子，开启植物抗寒机制新认知

本文聚焦植物间通信，研究发现茶树间存在双向通信，相邻植物可增强彼此耐寒性。接收植物释放的角鲨烯（Squalene）作为反馈信号，经角鲨烯 - 油菜素甾酮（CS） - BES1/BZR1 - CBF5 通路，提升发射植物耐寒性，为理解植物相互作用提供新视角。

　　### 引言
植物在面对外界刺激、抵御生物和非生物胁迫时，会产生并释放挥发性有机化合物（VOCs）。这些 VOCs 不仅能快速传递竞争或威胁信息，调节相邻植物的适应性反应，还参与植物与周围环境的相互作用。不过，并非所有挥发性信号都对相邻植物有益，比如番茄受烟粉虱侵害后释放的挥发性混合物会让相邻植物更易受侵害，干旱诱导的低剂量水杨酸甲酯（MeSA）会降低相邻茶树的抗旱性，这体现了植物间挥发性介导通信的复杂性。受损植物也能从这种通信中间接受益，像受损的鼠尾草枝条释放的挥发性信号可整合自身防御系统、抑制竞争植物发芽，还能降低对草食动物的吸引力。

尽管对植物间通信已有不少研究，但大多聚焦于相邻植物接收信号后的反应，对接收植物如何向发射植物反馈信号以及后续影响的了解却很有限。茶树作为全球重要的非酒精饮料原料，低温是其生长面临的一大挑战，限制了其生长、存活和地理分布。此前研究发现，冷诱导的挥发性化合物（如橙花叔醇、香叶醇、芳樟醇和 MeSA）能通过被吸收转化为糖苷或刺激 ICE - CBF - COR 通路，增强相邻茶树的耐寒性。然而，植物间通信的互惠性仍不明确，接收植物产生的信号能否让发射植物受益也有待探究。本研究发现，两株茶树幼苗一起时耐寒性更强，于是构建了低温下植物间相互作用模型，探究接收植物的反馈信号和发射植物的反应，揭示了植物间信息交换和相互支持的机制。

结果

1. 植物间通信是双向的：研究人员对比了有无相邻植物的茶树在低温环境下的耐寒性。结果显示，单株茶树在低温胁迫下比有相邻茶树的更易受伤害，这表明植物间通信不仅对接收植物有益，还能增强发射植物自身的耐寒性，证明了植物间通信是双向的。
2. 接收植物的反馈信号提高发射植物耐寒性：为研究接收植物对发射植物的影响，设计了反馈实验。先将健康和冷胁迫茶树的空气传播信号吹向接收植物 R1 和 R2 12 小时，收集 R1 和 R2 释放的 “响应 VOCs”，再吹回冷胁迫下的发射植物（分别设为对照 CK 和处理 T）。冷胁迫后，T 组植物耐寒性更强。通过测量 F_v/F_m值发现，CK 组植物在冷处理下 F_v/F_m值较低，说明其光系统 II 受损严重。同时，T 组植物叶片积累的 H₂O₂更少，DAB 和 NBT 染色显示其 H₂O₂和 O₂^?水平更低，丙二醛（MDA）含量也显著低于 CK 组，而过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）这两种关键抗氧化酶的活性则更高。
3. 检测接收植物的 VOC 反馈信号：将经健康发射植物（R1）和冷胁迫发射植物（R2）预处理的接收植物置于密封玻璃箱 12 小时积累 VOCs，用针捕微萃取（NTME）捕获并通过气相色谱 - 质谱联用（GC - MS）分析。结果发现，两组释放的角鲨烯含量差异显著，R2 释放的角鲨烯明显高于 R1，表明接收植物通过释放角鲨烯响应发射植物。
4. 响应信号增加 T 组植物冷胁迫下的 CS 含量和 CsCBF5 表达：对 T 组和 CK 组植物进行 RNA 测序（RNA - seq）转录组分析。12 个 cDNA 文库（3 个生物学重复）保留了超过 96.6% 的高质量清洁读数，Q20 值大于 99.96%，GC 含量为 43.5%。分析差异表达基因（DEGs）发现，冷胁迫诱导了大多数 DEGs 的表达，381 个 DEGs 受反馈信号诱导。KEGG 分析显示，许多 DEGs 参与倍半萜和三萜生物合成。检测发现，角鲨烯生物合成相关基因下调，油菜素内酯（BL）生物合成部分基因上调。研究 ICE - CBF/DREB1 通路发现，T 组和 CK 组植物的 CsICE1 和 CsCBF1/2/3 表达水平无显著差异，CsCBF4/6 表达略有下降，而 CsCBF5 表达显著上调。测量油菜素甾醇（BRs）水平发现，T 组植物的 CS 含量显著高于 CK 组，BL 和其他 BRs 水平无显著差异，且 RNA - seq 结果经定量聚合酶链反应（PCR）进一步证实，说明反馈信号通过诱导 CS 积累和 CBF5 表达增强茶树耐寒性。
5. 角鲨烯增强发射植物耐寒性：进行外源挥发性暴露实验，用与 R2 茶树释放量相同浓度的角鲨烯处理茶树，以二甲基亚砜（DMSO）处理为对照。室温下，处理组和对照组茶苗表型和抗氧化活性无显著差异，但角鲨烯处理可显著增加茶苗 CS 含量。冷胁迫下，角鲨烯处理的茶苗损伤更小，F_v/F_m值更高，H₂O₂和 MDA 积累更少，POD 和 SOD 酶活性更高，CsCBF5 表达显著诱导，CS 含量更高。用反义寡核苷酸（AsODNs）抑制 CsSQS 表达，沉默植株（AsSQS）角鲨烯产量下降，其反馈信号对接收植物耐寒性提升效果减弱，进一步证实角鲨烯的作用。
6. 角鲨烯通过诱导 CsCBF5 表达和 CS 积累提高发射植物耐寒性：用 AsODNs 抑制 CsCBF5 表达，对 CBF5 沉默（AsCBF5）和对照（sCBF5）茶树进行实验。结果显示，沉默 CsCBF5 降低了植物耐寒性，说明 CsCBF5 在冷胁迫下起正向调节作用。反馈信号对 sCBF5 茶树耐寒性提升效果在 AsCBF5 茶树中减弱，表明 CsCBF5 对反馈信号发挥作用至关重要。角鲨烯处理后，AsCBF5 茶树损伤更严重，证明角鲨烯通过 CsCBF5 提高发射植物耐寒性。

分析 CsCBF5 启动子区域发现有多个 E - box 基序。通过酵母单杂交、电泳迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶报告基因检测，鉴定出 CsBES1 基因，证实其在低温下正向调节 CsCBF5 表达。用油菜素唑（Brz）抑制 BR 生物合成，发现 Brz 处理的植物在冷胁迫下损伤更严重，角鲨烯不能增强其耐寒性，且 Brz 处理降低了 CsCBF5 表达，证实 BRs 与 CsCBF5 正相关，说明角鲨烯通过增加 CS 含量和激活 CsCBF5 表达增强发射植物耐寒性。

讨论

植物可通过多种方式通信，如根分泌物、丛枝菌根真菌，菟丝子还能在不同宿主间形成连接实现双向通信。植物挥发性化合物曾被视为代谢副产物，如今研究发现其在植物防御、与其他生物和环境相互作用中发挥重要作用。本研究观察到两株茶树幼苗比单株更耐寒，暗示自然条件下植物可能通过 VOCs 进行双向信号交换。

角鲨烯是动植物体内重要物质，在植物中可作为挥发性化合物，参与防御昆虫或吸引传粉者，且能快速在细胞内分布。油菜素甾醇（BRs）是一类类固醇激素，可协同其他植物激素影响植物生长、发育和抗逆性，CS 是具有强生物活性的 BR，低温下植物 CS 浓度会增加，角鲨烯作为植物甾醇前体，能使植物积累更多 CS，且角鲨烯通过 CS 提高植物耐寒性。

茶树有 6 个 CsCBFs，部分参与冷响应，但 CsCBF5 的调控机制此前并不明确。以往研究表明冷诱导 VOCs 通过激活 CsCBF1 - 3 提高相邻植物耐寒性，而本研究发现相邻植物反馈信号不激活 CsCBF1 - 3，而是特异性激活 CsCBF5，揭示了一条新的耐寒途径。此外，BR 信号通路在植物应对冷胁迫中也很关键，本研究鉴定出 CsBES1 并验证其对 CsCBF5 的正向调控作用，建立了茶树新的耐寒途径。

材料与方法

1. 植物材料：选用健康 1 年生茶树品种舒茶早幼苗，实验选取植株的前两片叶子，液氮速冻后 - 80°C 保存。
2. 化学试剂：角鲨烯、DAB、NBT 和 Brz 购自 Sigma - Aldrich（上海）。
3. 实验设计：对比有无相邻植物耐寒性实验，CK 组单株茶树、T 组两株相邻茶树，均在 4°C 处理 2 天，湿度 65%，光照周期 16 小时 / 8 小时。反馈实验分三步，包括信号激发、VOCs 富集和反馈，最后将茶树在 - 5°C 处理 3 小时评估耐寒性，实验过程中控制气体进出，保持湿度和光照周期。
4. 生理测量：用 Imaging - PAM 测量光系统 II 光化学最大效率（F_v/F_m），用 DAB 和 NBT 染色检测 H₂O₂和 O₂^?，用试剂盒分析 MDA、H₂O₂、POD 和 SOD 活性。
5. 检测反馈 VOC 信号：用 NTME 捕获富集后的挥发性化合物，通过 GC - MS 分析，根据 NIST 标准鉴定化合物，基于峰面积和标准曲线定量。
6. 挥发性暴露实验：用 DMSO 稀释角鲨烯处理茶树，以 0.1% DMSO 为对照，处理 12 小时后 - 5°C 处理 3 小时评估耐寒性。
7. RNA - seq 和生物信息学分析：提取茶树叶片总 RNA，反转录合成 cDNA，纯化、修复、连接测序接头后进行 Illumina HiSeq 2000 测序。过滤原始读数得到高质量清洁读数，组装注释，计算基因表达并归一化。
8. 定量实时 PCR 分析：用特定引物和 Hieff SYBRGreen Master Mix 进行实时 PCR，以甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶基因为内参，用 2^?ΔCT法计算相对表达量。
9. 植物激素检测：提取植物材料中的激素，用 UPLC - ESI - MS/MS 系统分析，添加内标精确测定 CS 和 BL 含量。
10. 茶树基因抑制：用 Soligo 软件设计 AsODNs，合成后注入茶树叶片沉默 CsCBF5 或 CsSQS 基因，以注射正义寡核苷酸为对照，处理 24 小时后进行后续实验。
11. Brz 抑制 BRs：用 Brz（5μM）处理茶树叶片抑制 BR 生物合成，以 0.005% DMSO 处理为对照，24 小时后暴露于角鲨烯 12 小时，检测耐寒性。
12. 酵母单杂交实验：扩增 CsCBF5 启动子序列克隆到 pHIS2.1 载体，扩增候选 BES1 转录因子 ORF 克隆到 pGADT7 载体，转化酵母测试转录因子与 CsCBF5 的靶向关系。
13. 双荧光素酶转录活性检测：构建 CsCBF5 启动子报告载体和 CsBES1 效应载体，农杆菌介导转化本氏烟草叶片，3 天后成像并测量荧光素酶活性。
14. 电泳迁移率变动分析：选择 CsCBF5 启动子区域含 E - box 元件的片段标记，制备反应样本进行电泳，转膜观察结果。
15. 数据分析：用 SPSS Statistics 20.0 分析数据，以均值 ± 标准差表示，通过单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 事后检验判断显著性，P < 0.05 为有统计学意义。