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本文利用超分辨率成像技术，对 5 种商用液相色谱材料中荧光分析物进行研究。发现化学功能化会阻塞固定相超 50% 的多孔内部，影响分析物进入。该研究为固定相设计提供新思路，助力优化液相色谱分离过程，极具科研价值。（HPLC：高效液相色谱）
研究背景
液相色谱分离在能源、时间和资金成本上耗费巨大。当前优化分离的方法主要是低通量、昂贵的试错法，难以洞悉分离成败的分子动力学机制，也无法明确改进方向。传统用于表征材料的非原位（ex situ）和整体平均技术，如氮气吸附等温线、电子显微镜、矩量法和反相尺寸排阻色谱（ISEC）等，存在诸多局限性，无法深入理解分离过程。而原位单分子超分辨率荧光显微镜技术，可在减少材料用量和时间的情况下，从分子层面理解和预测色谱性能，为研究带来新突破。
研究结果
- 成像吸附过程：研究选取了多种不同孔隙率和化学功能化的固定相色谱颗粒，包括纤维素 - B（Cellulose - B）、裸非功能化二氧化硅、表面多孔颗粒（SPPs）等。以罗丹明 6G 为模型分析物，通过微流体流动池引入，用高倾斜层叠光学（HILO）光片成像，利用单分子定位分析实现 30 - ± 20 - nm 横向和 340 - ± 50 - nm 轴向分辨率的超分辨成像，获取吸附动力学数据。
- 功能化颗粒内体积难以接近：超分辨率成像显示，Cellulose - B 和 Whelk - O1 全多孔颗粒（FPPs）中，分析物无法自由扩散，与传统认知不同。量化分析发现，这些功能化固定相的内孔可及性很低，如 Cellulose - B 只有 64 ± 2%r可被分析物到达，与有固体核的 Whelk - O1 SPPs 相似，远低于裸二氧化硅 FPPs 的 84 ± 3%r。
- 传统表征方法的局限性：氮气吸附等温线结合 BET 分析以及扫描电子显微镜（SEM）等传统方法，无法准确区分 Cellulose - B 和非功能化二氧化硅的差异，不能发现功能化 FPPs 中内孔对小分析物的不可接近性。而通过超分辨率成像量化分析物可探测的横截面积与固定相总成像面积的比值，能更直接地反映在溶剂化条件下的有效可及孔隙率。
- 去除功能化涂层增加孔隙可及性：确定功能化程度高导致空间位阻是孔隙可及性低的原因。用二甲基亚砜（DMSO）处理去除纤维素多糖涂层后，Cellulose - B 的孔隙可及性显著增加，用 100% DMSO 处理后，分析物可到达距离达到 86 ± 3%r，接近二氧化硅的水平。飞行时间二次离子质谱（ToF - SIMS）成像证实了功能化多糖涂层阻塞孔隙，且处理后功能化未完全去除。
- 吸附动力学预测洗脱趋势：单分子测量的时间数据可预测整体色谱洗脱行为。基于随机色谱理论，通过对吸附事件的建模，发现 DMSO 处理虽未显著改变单分子停留时间分布，但减少了罕见的长时间吸附，使洗脱时间提前。大规模高效液相色谱（HPLC）实验验证了模型洗脱曲线的趋势，表明 DMSO 处理改变了可及性和传质，导致更快洗脱。
讨论
超分辨率成像揭示了功能化固定相中的孔隙阻塞现象，这在以往仅为传闻和间接推断。该研究确定了表面配体过多是原因，去除后可加速洗脱、降低传质阻力，为理解选择性 / 渗透性权衡和生物分析物树脂纯化提供了新视角。单分子传质分析可直接预测 HPLC 洗脱趋势，与传统假设不同，明确了吸附动力学在柱规模分离中的主要作用。与传统方法相比，原位超分辨率荧光显微镜能在更接近实际的条件下直接、无损地测量。同时，该技术资源消耗低，适用于新型固定相的测试开发，但也存在一些局限，如对荧光信号的依赖、溶剂处理的非靶向性和压力范围限制等。未来可开发特定算法、提高压力成像能力等，以拓展其在色谱领域的应用。
