揭秘 CAR 信号架构：解锁 T 细胞抗癌潜能，开启精准免疫治疗新征程

本文利用组合筛选和单细胞测序，研究嵌合抗原受体（CAR）信号架构对 T 细胞激活和持久性的影响。构建 32 种 CAR 变体库，经重复抗原刺激等实验，发现 CD40 等关键域的作用，还关联体外 CAR T 细胞表型与临床结果，为 CAR 工程提供关键参考。

　　### 研究背景
嵌合抗原受体（CAR）T 细胞是一种新兴的癌症治疗策略。CAR 由细胞外抗原结合域与细胞内信号域融合而成，能引导 T 细胞识别并清除肿瘤细胞，同时诱导持久的记忆免疫。目前已有 7 种 CAR T 细胞疗法获 FDA 批准用于治疗血液恶性肿瘤，还有超千项临床试验正在开展。然而，CAR T 细胞疗法面临诸多挑战，如毒性、肿瘤浸润差、T 细胞耗竭和持久性不足等，限制了其临床疗效。

为解决这些问题，研究人员设计了不同的 CAR，探索细胞内信号元件对 T 细胞功能的影响。通过改变信号域的选择、数量和排列顺序，已发现一些新的 CAR 设计具有独特的抗肿瘤特性。同时，高通量筛选方法也被用于工程化改造 CAR，以获得更优的功能特性。但目前对 CAR 信号架构如何影响 T 细胞功能和转录表型的理解仍有限，T 细胞表型随时间的动态变化也有待进一步研究。

实验设计

为系统研究 CAR 信号架构对 T 细胞功能的影响，研究人员构建了一个组合信号域库。该库基于一、二、三代 CAR 设计，包含 32 种不同的 CAR 变体。所有 CAR 均具有相同的细胞外结构域，能特异性结合人表皮生长因子受体 2（HER2），这是一种在多种实体癌中存在的肿瘤相关抗原。细胞内结构域则由 CD3ζ 激活域与 5 种不同免疫受体的共刺激信号域组合而成，包括常用的 CD28 和 4-1BB，以及在临床前研究中表现出增强 CAR 抗肿瘤特性的 CD40、IL-15 细胞因子受体 α 链（IL15RA）和作为抑制性受体但可能增强抗肿瘤反应的 CTLA4。此外，还设计了一种无信号 CAR（NS-CAR）作为阴性对照。

研究人员利用 CRISPR-Cas9 和同源定向修复（HDR）技术，将 CAR 库基因组整合到原代人 T 细胞的 T 细胞受体 α 链（TRAC）位点。这样可确保每个变体在相同转录调控下表达，同时敲除 TCR，便于以混合方式比较库中的候选变体。经基因组编辑后，通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出 CAR 表面表达阳性且 TCR 表达阴性的工程化 T 细胞。

实验结果

1. 评估库在重复抗原刺激（RAS）后的持久性：通过体外 RAS 实验模拟肿瘤细胞的慢性抗原刺激。将混合的 CAR T 细胞库与表达 HER2 的 SKBR3 细胞共培养 12 天，每 3 天用新鲜的 SKBR3 细胞重新刺激，并通过流式细胞术评估 T 细胞的效应潜能。结果显示，在 RAS 实验早期（第 3 天），CAR T 细胞库具有较强的效应潜能，但随着时间推移逐渐下降，表明该实验可有效模拟 CAR T 细胞的渐进性耗竭。在实验过程中，CD8 T 细胞比 CD4 T 细胞更快失去效应能力，CD8 T 细胞的比例也逐渐下降，而 CD4 T 细胞的寿命似乎更长。
   在第 9 天，CAR T 细胞库达到预功能障碍状态，此时通过 FACS 筛选出仍对效应标记（CD107a 或 IFN-γ）呈阳性的细胞，以评估不同 CAR 的持久性。结果发现，位于细胞膜近端位置 A 的 CD40 信号域是 T 细胞持久性的关键驱动因素，在所有组中均导致较高的富集分数；而位于位置 B 的 CD40 虽富集分数较低，但仍能促进 CD8 细胞的促炎表型。此外，位于位置 B 的 CTLA4 在 CD107a⁺细胞中富集，似乎可驱动更持久的细胞毒性表型；CD28 和 4-1BB 信号域则诱导适度或降低的持久性。
2. 单细胞转录分析解析 CAR 诱导的表型：利用单细胞 RNA 测序（scRNAseq）、单细胞细胞转录组和抗原表位细胞索引（scCITEseq）和单细胞 CAR 测序（scCARseq）技术，对 RAS 实验不同时间点的 CAR T 细胞库进行分析。scRNAseq 数据经降维、聚类后，将细胞分为 16 个不同的簇，这些簇基于 CD4 和 CD8 表达、细胞周期阶段预测以及关键 T 细胞标记基因的差异表达进行注释。
   随着时间推移，T 细胞表型从记忆和早期激活状态逐渐转变为强效效应表型，最终发展为晚期功能较弱的状态，这与 scCITEseq 数据中 T 细胞激活标记的表面表达、RNAvelocity 分析结果以及样本采集时间点相符。通过 scCARseq 对 CAR 库进行解复用，发现 NS-CAR 的 T 细胞在早期和晚期均处于静止记忆表型，而其他 CAR 均能触发 T 细胞激活，表现为缺乏静止记忆表型的细胞。
3. 信号域组合在 CAR T 细胞早期激活中的作用：研究人员在肿瘤共培养 6 小时后检查转录表型，以了解信号域组合如何塑造 T 细胞的早期激活。对于 CD8 和 CD4 亚群，细胞沿着 T 细胞分化轴分离。在 CD8 细胞中，位置 A 的 CD40 域似乎是快速强效效应表型的主要驱动因素；而 4-1BB 包含的 CAR 虽仍能激活，但触发的是较弱但更强的效应记忆样表型。在 CD4 细胞中，CTLA4 包含的 CAR 似乎驱动最强的激活和分化，而 CD40、CD28 和 4-1BB 则保持整体的 CD4 效应记忆表型。
   通过单细胞基因集评分进一步解析激活特征，发现所有 CAR 构建体均能触发强烈的细胞毒性表型，但位置 A 的 CD40 域驱动的细胞毒性和促炎表型尤为突出，且当 CD40 域重复时更为明显。4-1BB 包含的 CAR 则高度富集记忆表型特征。
4. CAR 共刺激对长期 T 细胞持久性的调节作用：CAR T 细胞疗法的一个常见限制是 T 细胞的短暂持久性，这会导致无法控制肿瘤生长和疾病进展。研究人员利用 RAS 实验研究 T 细胞表型在 CAR 库中的进展。在 CD8 亚群中，观察到两个仍具有效应潜能的簇（促炎和细胞毒性簇），以及其他逐渐失去效应标记基因表达、达到功能障碍和最终死亡的簇。以 RAS 后期（12 天）促炎和细胞毒性簇的富集作为持久性的标记，发现 CD40（主要在位置 A）是长期持久性的关键域，4-1BB 和 CTLA4 促进后期细胞毒性表型，但不促进促炎表型；IL15RA 和 CD28 则使大部分细胞已转变为功能障碍表型。
   考虑到 CD8 细胞数量随时间的下降，结合 CD8/CD4 比值变化和晚期效应簇的富集，得到更全面的持久性评分，结果再次表明 CD40 诱导的持久性最强，其次是 CTLA4。在 CD4 亚群中，鉴定出促炎辅助性 T 细胞 1（T_H1）和多功能 T_H2 簇等功能簇。CD40 持续驱动最持久的促炎特征，在 T_H1 簇中富集最多；CTLA4 和 4-1BB 促进 T_H2 富集的持久表型；而 CD28 包含的 CAR 在功能障碍簇中富集最多，表明其诱导的持久性较差。
5. 将体外 CAR 库表型与急性淋巴细胞白血病（ALL）患者临床结果关联：为使研究结果更具临床相关性，研究人员开发了一种策略，将体外 CAR 库 T 细胞产品的表型映射到体外刺激的患者来源 CAR T 治疗输注产品（tisa-cel；抗 CD19-BBz CAR）的 scRNAseq 数据上，这些产品用于治疗 12 例 ALL 儿科和年轻成人患者。
   分析发现，未刺激的输注产品中静止记忆簇富集，体外刺激 6 小时后，大部分细胞转变为早期激活的 CAR T 细胞表型。与完全缓解（CR）和复发（RL）患者相比，无反应（NR）患者在激活或细胞毒性 CD8 表型以及 CD4 激活记忆表型中的富集减少。在 CD8 亚群中，CR 患者早期细胞毒性表型富集，RL 患者激活表型富集；CR 患者在 CD4 激活记忆表型上也比 RL 患者更富集。尽管由于样本量小和患者间差异大，这些观察结果无统计学意义，但 CD8 早期细胞毒性和 CD4 激活记忆表型的富集似乎与 ALL 患者更好的临床反应相关。基于这些表型对库候选物评分表明，包含 CD40 信号域（特别是在位置 A）的 CAR 可能触发在 ALL 临床环境中更可能成功的 T 细胞表型。

讨论

域重组在信号网络进化中至关重要，CAR 作为理性域重组的产物，可通过进一步的信号域重排进行优化。本研究结合组合 CAR 信号域库、混合筛选测定和 scRNAseq，系统研究了 CAR 诱导表型的动态变化。
研究评估了 5 种免疫受体信号域重组的影响，发现不同 CAR 设计能引发不同的 T 细胞激活反应。CD28 诱导强效但持久性较差的 T 细胞激活，4-1BB 促进效应记忆表型；CD40 始终触发最强效和持久的 T 细胞反应；CTLA4 虽为抑制性受体，但嵌入 CAR 信号架构中可促进强大的 T 细胞反应，特别是在 CD4 亚群中，具有持久的细胞毒性表型；IL15RA 细胞质域似乎未提供有效的 T 细胞共刺激，可能起分子间隔作用。
在域定位方面，靠近细胞膜的域对表型起主导作用，但远端域也有影响。例如，CD40 和 4-1BB 在膜近端位置分别诱导效应或记忆表型极化；CTLA4 在膜远端位置促进细胞毒性的作用更突出。
本研究也存在一些局限性。在混合筛选中，旁分泌信号导致的旁观者效应是一个问题，虽通过 NS-CAR 作为阴性对照评估了其影响，但仍需注意。此外，确保库的平衡至关重要，否则会影响结论的可信度。同时，体外共培养难以完全模拟临床环境，目前对 CAR T 细胞表型与临床结果的相关性了解有限，需要进一步的功能验证。
尽管如此，本研究通过计算分析将体外表型与临床反应联系起来，为 CAR 库筛选提供了一种基于临床反应的方法。这种方法虽不能替代在临床相关模型中的直接实验验证，但代表了一种有价值的转录组数据驱动的选择工具，可加速针对特定临床适应症的 CAR 库筛选。未来需要更多此类数据集，以进一步开发筛选工具，缩小临床前模型与临床性能之间的差距。