胆囊癌全长转录组图谱揭示 ERBB2 可变剪接介导曲妥珠单抗耐药新机制

为解决胆囊癌靶向治疗耐药问题，上海交通大学医学院附属仁济医院的研究人员开展胆囊癌转录组研究。他们发现 ERBB2 i14e 致曲妥珠单抗耐药，干预它可增敏。该成果为胆囊癌治疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

上海交通大学医学院附属仁济医院（Department of Biliary-Pancreatic Surgery, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine）的研究人员 Ziyi Wang、Li Gao 等人在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了题为 “Full-length transcriptome atlas of gallbladder cancer reveals trastuzumab resistance conferred by ERBB2 alternative splicing” 的论文。这篇论文在胆囊癌（Gallbladder cancer，GBC）研究领域意义重大，为深入了解胆囊癌的发病机制、治疗靶点以及克服靶向治疗耐药性提供了关键线索，有望推动胆囊癌精准治疗的发展。

研究概述

该研究通过构建胆囊癌全长转录组图谱，发现了一种新的 ERBB2 异构体（ERBB2 i14e），揭示了其促进肿瘤细胞增殖和导致曲妥珠单抗（trastuzumab）耐药的机制，并探索了干预该异构体以提高曲妥珠单抗治疗敏感性的方法。

研究背景

胆囊癌是消化系统中恶性程度较高的肿瘤之一，由于早期症状不典型，多数患者确诊时已错过手术时机，只能依赖化疗和靶向治疗。然而，目前针对胆囊癌的基础研究匮乏，有效的靶向治疗策略有限。受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases，RTKs）在肿瘤发生发展中起关键作用，其中 ERBB2 被证实可驱动多种癌症发展，也是胆囊癌极具潜力的治疗靶点。曲妥珠单抗是首个获批用于癌症治疗的抗 ERBB2 单克隆抗体，但在乳腺癌治疗中，约三分之二的患者会产生耐药性。RNA 可变剪接（RNA alternative splicing）在肿瘤发生发展中也扮演重要角色，它能产生多种 mRNA 异构体，进而翻译出不同的蛋白质亚型，影响肿瘤的各种生物学行为。不过，目前常用的短读长测序技术无法全面呈现 RNA 的全貌，长读长测序技术则为深入研究 RNA 提供了有力工具。

研究方法

1. 样本采集与测序：收集正常胆囊上皮组织、胆囊癌组织及细胞系样本。对样本进行长读长转录组测序（使用 PacBio Sequel II 系统）和短读长测序。长读长测序用于构建转录组图谱，短读长测序用于量化转录本表达。
2. 数据处理与分析：对长读长测序数据进行处理，获取高质量（HQ）数据并映射到人类参考基因组，去除冗余异构体，筛选低表达和可能的假阳性转录本。利用相关软件对转录本进行注释、分类和功能富集分析。对短读长测序数据进行质量控制、比对和表达定量分析。
3. 细胞与动物实验：培养多种细胞系和患者来源的类器官（organoid），进行细胞增殖实验、克隆形成实验、免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）、蛋白质印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）、流式细胞术（Flow cytometry）等实验。构建细胞来源的异种移植（Cell-derived xenograft，CDX）模型和患者来源的异种移植（Patient-derived xenograft，PDX）模型，进行体内药物治疗实验。
4. 其他实验：制备针对 ERBB2 i14e 的特异性抗体，构建 Minigene 质粒研究可变剪接调控机制，设计反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASOs）干预 ERBB2 i14e 表达。

研究结果

1. 胆囊癌长读长全长转录组图谱揭示 RTKs 的高度多样性
   • 转录组图谱构建：对正常胆囊上皮、胆囊癌组织及细胞系样本进行长读长转录组测序，共检测到 61,676 个转录本，来自 13,109 个基因。多数转录本长度在 1 - 4 kb，部分基因表达多种异构体。通过与参考注释对比，将转录本分类为已知和新型异构体，并构建了胆囊癌转录组图谱，其中包含 23,435 个新型异构体等。
   • 功能分析：对新型蛋白编码异构体进行功能富集分析，发现 RTKs 是富集的主要功能类别之一，表明长读长转录组图谱定义了大量在胆囊癌中功能重要但此前被忽视的蛋白编码转录本异构体，尤其在 RTK 通路中。
   
   
2. 一种新型 ERBB2 异构体在癌细胞中高表达，与细胞增殖和患者生存相关
   • 异构体发现与鉴定：在 23 种 RTK 基因中，ERBB2 和 DDR1 的转录组异构体多样性最高。通过对多个独立的短读长 RNA 测序队列分析，发现 5 种新型 ERBB2 异构体在癌组织中表达显著高于癌旁组织，其中一种包含来自内含子 14 的新外显子的异构体 ERBB2 i14e，在约 25.5% 的胆囊癌 RNA - seq 样本中可检测到，且与患者较差的预后相关。
   • 功能验证：将含有 ERBB2 i14e 和野生型 ERBB2 编码序列的质粒转染到 GBC - SD 细胞中，在有 NRG1（ERBB3 的配体）存在时，ERBB2 i14e 能显著促进细胞增殖。体内实验也表明，过表达 ERBB2 i14e 的细胞形成的肿瘤体积更大。
   
   
3. ERBB2 i14e 通过 ERBB3 增强细胞增殖
   • 分子机制研究：在 GBC - SD 和 ZJU - 0430 细胞系中异位表达 ERBB2 i14e 或野生型 ERBB2，结果显示 ERBB2 i14e 与 ERBB3 共表达且在 NRG1 存在时，比野生型 ERBB2 诱导更强的细胞增殖。ERBB2 i14e 能促进更高水平的磷酸化 ERBB3 和 AKT，AKT 抑制剂可消除其诱导的增殖。免疫共沉淀实验证实 ERBB2 i14e 与 ERBB3 的相互作用更强，蛋白质结构分析表明 i14e 肽位于 ERBB2 细胞外 IV 结构域，可作为与 ERBB3 相互作用的接头。
   
   
4. ERBB2 i14e 的获得性表达导致曲妥珠单抗耐药
   • 耐药机制研究：曲妥珠单抗可抑制野生型 ERBB2 表达细胞的增殖，但对表达 ERBB2 i14e 的细胞无效。体内外实验表明，ERBB2 i14e 携带的肿瘤对曲妥珠单抗治疗无反应，其原因是 i14e 肽导致空间位阻，阻止曲妥珠单抗与 ERBB2 细胞外 IV 结构域结合，从而使癌细胞对曲妥珠单抗产生耐药性。
   • 耐药相关性验证：在 PDX 模型中，曲妥珠单抗治疗后肿瘤中 ERBB2 i14e 表达显著增加。在其他癌症细胞系（如乳腺癌细胞系 SKBR3 和胃癌细胞系 MKN1）中也发现，曲妥珠单抗治疗可诱导 ERBB2 i14e 表达增加，表明 ERBB2 i14e 的诱导表达与多种癌症对曲妥珠单抗的耐药性相关。
   
   
5. 干预 ERBB2 i14e 可增加曲妥珠单抗敏感性
   • 调控机制研究：对 439 种剪接因子进行差异基因表达分析，发现 ESRP1、ESRP2 等 6 种因子可能介导 ERBB2 i14e 外显子的可变剪接。过表达 ESRP1 和 ESRP2 可诱导 ERBB2 i14e 表达，且 ERBB2 i14e 表达与 ESRP1 在胆囊癌组织中呈正相关。ESRP1/2 通过结合 i14e 外显子下游的 UGG 富集区域促进其包含在成熟 mRNA 中。
   • 干预效果验证：设计针对 ERBB2 i14e 不同剪接位点的 ASOs，发现针对 5’剪接位点（ASO1）的 ASO 抑制效果最强，且 ASO1 与针对 ESRP1/2 结合位点（ASO4）的 ASO 联合使用具有协同抑制作用。在类器官和 PDX 模型中，使用 ASOs 或 vivo - MO（一种体内有效的 ASO）干预 ERBB2 i14e 表达，可增强曲妥珠单抗或曲妥珠单抗 - 药物偶联物（如 T - DXd）的治疗效果，抑制肿瘤细胞生长。
   
   

研究结论与讨论

该研究利用长读长测序技术构建了胆囊癌全长转录组图谱，发现了新型 ERBB2 异构体 ERBB2 i14e。它在胆囊癌中高表达，可促进癌细胞增殖，还导致对曲妥珠单抗的耐药性。ESRP1/2 通过调控 ERBB2 i14e 的可变剪接影响其表达，针对 ERBB2 i14e 5’剪接位点的 ASOs 可增强曲妥珠单抗治疗敏感性。这一研究为胆囊癌的研究提供了新的视角和潜在治疗策略，也为解释其他癌症中曲妥珠单抗耐药现象提供了参考。不过，目前研究仍存在一些局限性，如多数胆囊癌细胞系不适合用于研究 ERBB2 i14e 高表达相关机制，未来需要开发更多合适的体外模型。此外，针对 ERBB2 i14e 的单克隆中和抗体和 ADC 的研发也有待进一步探索，以提高对表达 ERBB2 i14e 癌症的治疗效果。总体而言，该研究成果为胆囊癌及相关癌症的治疗带来了新的希望和研究方向，对推动肿瘤精准治疗具有重要意义。