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为解决体外 hTM 细胞研究结果难以转化至体内的问题，贝勒医学院的研究人员开展单细胞转录组学研究。他们发现体外培养与体内组织的 hTM 细胞存在差异。这为眼部疾病研究及优化体外模型提供依据，值得科研人员阅读。
美国贝勒医学院（Baylor College of Medicine）分子与人类遗传学系的 Alice Tian 等人在《Scientific Data》期刊上发表了题为 “Divergence in cellular markers observed in single-cell transcriptomics datasets between cultured primary trabecular meshwork cells and tissues” 的论文。这项研究对于青光眼等眼部疾病的研究有着至关重要的意义，为深入理解小梁网（trabecular meshwork，TM）细胞的特性以及体外研究与体内研究的差异提供了关键线索，有望推动眼部疾病治疗手段的发展。
论文摘要指出，眼睛流出通道中的小梁网在维持眼内压平衡方面起着关键作用。以往，体外研究常使用人小梁网（human trabecular meshwork，hTM）原代细胞培养来探究小梁网功能障碍的病理生物学，但体外研究结果向体内研究转化存在困难。本研究通过单细胞 RNA 测序，对 14 个原代 hTM 体外样本（包括 4 个青光眼患者样本）和新鲜解剖的人小梁网组织进行比较，识别出多个小梁网细胞特异性标记基因，还发现体外培养的原代 hTM 细胞与体内组织相比，细胞异质性显著降低，转录组谱也发生了明显变化。
原发性开角型青光眼（Primary open angle glaucoma，POAG）是一种会导致不可逆视力丧失的严重眼部疾病。降低眼内压（intraocular pressure，IOP）是控制青光眼视野缺损的唯一可调节风险因素。小梁网位于眼睛前段，是房水流出的主要部位。小梁网功能障碍，受组织驻留细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的影响，会导致房水流出阻力增加和眼压升高（ocular hypertension，OHT） 。小梁网在解剖学上具有异质性，由近小管区（juxtacanalicular region，JCT）、角膜巩膜小梁网和葡萄膜巩膜小梁网等区域组成，其中近小管区周围和施莱姆管（Schlemm’s canal）内壁细胞被认为是房水流出阻力的主要部位。
在药物研发和作用机制研究中，体外培养的原代小梁网细胞发挥着重要作用，但体外研究结果难以转化到临床应用。这是因为眼部组织结构、生理、微环境以及物种差异等因素，使得体外难以模拟生物体内的复杂情况。而且，小梁网的生理和解剖结构复杂，存在功能异质性，不同区域的细胞在细胞外基质组成、生物力学特性和分子信号通路等方面都有所不同。另外，原代 hTM 细胞在体外培养时，细胞身份存在异质性，会随时间变化，且不同供体来源的细胞也存在差异，同时细胞的机械记忆等因素也可能影响细胞特性，这些都促使研究人员开展此项研究，以进一步了解小梁网细胞的特性和体外研究的局限性。
研究人员从被判定不适合移植的人供体角膜缘分离原代 hTM 细胞，这些细胞来自非青光眼和青光眼供体，经过组织解剖后进行培养，并通过鹅卵石样形态外观和地塞米松诱导的肌联蛋白（myocilin，MYOC）表达进行验证。同时，从死后 4 - 6 小时内的供体眼球前段或整个眼球中解剖获取用于单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）的小梁网组织。
将重悬的单细胞加载到 10X Chromium 控制器上，以获得单细胞凝胶珠乳液（Gel Beads-In-Emulsions） 。使用 10X Chromium Single Cell 3′试剂试剂盒 v3.1（10X Genomics），按照制造商的建议生成 scRNA-seq 文库，在贝勒医学院单细胞基因组学核心实验室的 Illumina Novaseq 6000 上进行测序。
原始测序读数通过 CellRanger v6.1.2（10X Genomics）流程，对照 hg38 参考基因组进行处理。然后，通过质量控制流程（
https://github.com/lijinbio/cellqc）对每个样本分别进行质量控制，使用 dropkick v1.2.8 过滤掉假阳性细胞，用 SoupX v1.6.2 去除环境 RNA，通过 DoubletFinder 检测并去除双细胞。合并所有样本后，手动进一步过滤细胞（特征数 > 300，转录本（UMI）计数 > 500，线粒体百分比 < 5%） 。
将每个样本的原始计数合并，使用 scVI 模型（n_layers = 2，n_latent = 30 ）从由 scanpy v1.9.1 计算出的前 2000 个高变基因（highly variable genes，HVGs）的原始计数中推断出 30 维的潜在空间，将样本 ID 作为批次协变量提供给 scVI 模型。使用 UMAP（min_dist = 0.3）进一步降低潜在空间维度，并在 scVI 潜在空间上进行 leiden 聚类（分辨率 = 0.5），使用 k 近邻图（邻居数 = 20） 。
利用 Seurat 去除细胞周期效应，使用 sccaf 验证聚类分辨率。最初使用 scPred，基于实验室体内组织样本生成的参考数据集进行细胞类型注释，然后使用已知的细胞类型标记基因重新注释聚类，并使用 scanpy，根据先前出版物中的特定标记为每个聚类分配细胞类型。使用 dittoseq 生成细胞比例图 。
使用 Seurat 识别不同细胞类型中差异表达的基因，确定每个聚类中特异性表达的基因，并对每个聚类中表达的前 5 个基因进行排名。
分别使用 scPred 确定 3 个体内 hTM 细胞样本的细胞类型，然后将仅包含体内数据的整合对象与相同的已知细胞类型标记基因进行比较，以确定体内样本的有效性。按照上述相同参数和协议，将组织培养数据进行整合，然后再次将合并的组织 + 培养对象与已知细胞类型标记基因进行比较，观察基因表达的差异。
细胞计数与质量控制结果
对 14 个样本进行质量控制后，每个样本平均分析约 6000 个细胞，总共约 82k 个细胞。各样本经过 Dropkick、SoupX 等步骤处理后，最终得到的细胞数量在 3257 - 13340 不等（见表 3）。这些数据表明实验过程中细胞的质量和数量得到了有效控制，为后续分析提供了可靠基础。
细胞聚类与标记基因分析
通过聚类分析，共得到 5 个聚类。其中 3 个聚类（TM_Culture_Cell、Proliferating_Culture_Cell 和 Stressed_Culture_Cell）在所有供体中都存在，另外两个聚类仅在 hTM_7987 样本中出现，这说明 hTM 细胞在培养中的群体并不均匀，存在一定的异质性。研究还鉴定出多个小梁网细胞特异性标记基因，如几丁质酶 3 样蛋白 1（Chitinase 3 Like 1，CHI3L1）、基质 γ - 羧基谷氨酸蛋白（matrix gla protein，MGP）和肌联蛋白（MYOC）等，它们分布在不同聚类中。MYOC 主要在 TM_Culture_Cell 聚类中表达，CHI3L1 和 MGP 在 BeamCell 聚类中含量丰富。此外，一些基质蛋白，如胶原蛋白 1/6、FBLN、FN、POSTN 和 DCN 在 BeamCell 和 Fibroblast 聚类中富集，PCOLCE 在 TM_Culture_Cell 和 Proliferating_Culture_Cell 聚类中富集（见图 4）。这些结果进一步证明了不同细胞聚类的特性差异。
组织样本分析结果
对组织样本单独进行分析，平均每个样本分析约 8100 个细胞，总共约 24k 个细胞。使用 scPred 分配细胞类型，得到 9 种定义的细胞类型和少数未分配细胞（见图 5）。通过先前鉴定的标记基因验证聚类和细胞类型分配，确认数据适合进一步分析。这表明组织样本的分析结果可靠，可与体外培养细胞数据进行有效对比。
体内外数据比较结果
当将原代 hTM 细胞的转录组与小梁网组织的转录组叠加时，发现细胞身份存在显著差异。体外培养的细胞与体内组织相比，细胞异质性降低，转录组谱发生显著变化（见图 6）。而且，比较青光眼和非青光眼供体培养的原代 hTM 细胞，发现细胞类型标记或聚类没有显著差异，但无论疾病状态如何，原代 hTM 细胞与人体组织的转录组谱都存在差异。这说明体外培养细胞无法完全模拟体内组织的细胞特性，为研究体外模型的局限性提供了重要依据。
本研究通过对原代 hTM 细胞和小梁网组织的单细胞转录组分析，发现体外培养的原代 hTM 细胞与体内组织相比，细胞异质性明显降低，转录组谱发生显著变化。虽然鉴定出了一些小梁网细胞特异性标记基因，但这些标记基因在体外培养过程中的变化机制尚不清楚，而且体外培养细胞可能发生去分化等现象，其与体内组织细胞特性差异的具体原因也有待进一步研究。
这项研究意义重大。它揭示了体外培养原代 hTM 细胞与体内组织细胞的差异，让科研人员对小梁网细胞的特性有了更深入的认识，为青光眼等眼部疾病的研究提供了关键数据。同时，研究结果也指出体外培养模型存在的局限性，提示在利用体外模型进行研究时需要谨慎对待结果，为后续优化体外培养条件、开发更有效的研究模型提供了方向。未来，随着类器官、微生理系统和生物打印等技术的发展，有望建立更接近体内真实情况的模型，进一步推动眼部疾病发病机制和治疗方法的研究，为青光眼等眼部疾病的治疗带来新的希望。
