羊皮肤中 tRNA 衍生小 RNAs 在幼体与成体间的差异表达 —— 解锁发育与免疫调控新密码

为探究 tRFs 在羊生长发育中的调控作用，宁夏大学的研究人员开展羊皮肤中 tRNA 衍生小 RNAs 差异表达的研究。结果发现其在幼体与成体有显著差异。该研究为羊发育及免疫研究提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

宁夏大学动物科学技术学院（College of Animal Science and Technology, Ningxia University）的研究人员 Lina Ma 等人在《BMC Genomics》期刊上发表了题为 “Differential expression of tRNA-derived small RNAs in Juvenile and adult sheep skin: implications for developmental and immune regulation” 的论文。这篇论文在羊的生长发育以及免疫学研究领域意义重大，它为深入了解羊在不同生长阶段的基因调控机制提供了新的视角，也为相关疾病的研究和防治提供了潜在的靶点和理论依据 。

一、研究背景

tRNA 片段（tRNA fragments，tRFs）是一类由成熟 tRNA 分子切割产生的小非编码 RNA 分子。别看它们个头小，作用可不容小觑！它们在基因表达调控、各种生物过程以及疾病发生发展中都扮演着关键角色。这些片段主要由特定的核糖核酸酶，像血管生成素（angiogenin）和 Dicer，对完整的 tRNA 分子进行靶向切割产生，其长度在 14 到 30 个核苷酸不等，而且根据在 tRNA 结构中的来源不同，还能分成 5'tRFs、3'tRFs 和内部 tRFs 等不同类别 。

tRFs 参与了众多细胞活动，比如基因沉默（让某些基因 “安静” 下来，不发挥作用）、应激反应（帮助细胞应对各种压力）以及翻译调控（控制蛋白质的合成过程）。在临床研究中，tRFs 作为多种疾病（如癌症、神经退行性疾病和代谢紊乱等）的潜在诊断和治疗靶点，受到了越来越多的关注。

此前，研究发现 tsRNAs 在不同物种中都起着重要作用。在猪身上，它与宫内生长受限（intrauterine growth restriction，IUGR）有关；在人类中，它参与基因表达调控，并且其生物发生和 RNA 修饰与多种疾病相关；在牛身上，tsRNAs 在病毒感染期间参与免疫反应调节；在鸭子中，tsRNA - 00764 能调控卵泡发育。然而，在羊的研究领域，除了之前有一项关于 tsRNAs 与羊毛纤维直径关系的研究外，相关研究少之又少。而皮肤作为哺乳动物最大的器官，是研究发育和疾病的理想模型。因此，本研究以羊的皮肤组织为对象，探究 tRFs 在羊生长发育过程中的表达模式及其潜在调控网络，这对于深入了解羊的生长发育机制意义非凡 。

二、研究方法

1. 样本制备与测序：研究人员选取了 10 只中国滩羊母羊，将它们分成两组，5 只 1 月龄的羔羊组成新生组，5 只 24 月龄的成年母羊组成成年组。这些羊都来自宁夏回族自治区吴忠市盐池县的一个养殖场，并且在相同的饲养条件下生活。研究人员用 5 毫米直径的皮肤活检打孔器，在羊的肩部和额头皮下组织注射 2% 利多卡因局部麻醉后采集皮肤样本，采集后迅速放入液氮中保存，用于后续的 RNA 测序。在 RNA 提取时，研究人员使用 Qiagen RNeasy Mini Kit（德国 Qiagen 公司产品），并对方法进行了改进以富集小 RNA 部分。之后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行大小分级分离，筛选出长度小于 200 个核苷酸的 RNA 分子，减少长链 RNA 的污染。接着用 NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set（美国 New England Biolabs 公司产品）进行高通量测序文库构建，经过一系列复杂的操作，包括在小 RNA 的 5' 和 3' 端连接接头、使用 SuperScript IV 逆转录酶（美国 Invitrogen 公司产品）进行逆转录以及用 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（美国 Thermo Fisher Scientific 公司产品）进行扩增。最后在 Illumina NextSeq 500 平台（美国 Illumina 公司产品）上进行单端测序，读长为 50 碱基。
2. 数据处理与映射：测序完成后，研究人员先用 FastQC 工具进行质量检查，用 Trim Galore 去除接头序列，去除低质量的 reads。然后将清洗后的 reads 与参考基因组（GCF_016772045.1_ARS - UI_Ramb_v2.0_genomic.fna）进行比对，使用专门针对小 RNA 数据的比对软件，如 Bowtie 2 或 STAR。Bowtie 2 采用严格比对模式，最多允许 1 个错配；STAR 则采用唯一比对模式，确保 reads 能准确地匹配到基因组位置上。为了准确识别 tRNA 衍生片段（tRFs），研究人员还使用了 tRNA 特异性数据库（tRFdb）。
3. tRF 鉴定与分析：通过 tRFfinder 和 MINTmap 软件，研究人员对 tRNA 衍生片段（tRFs）进行鉴定，确定其精确的切割位点和长度，并根据它们在前体 tRNA 分子中的来源，将其分类为 tRF - 5s、tRF - 3s 和 i - tRFs 等类别。使用 DESeq2 算法对 tRFs 的表达水平进行标准化定量分析，筛选差异表达 tRFs 的标准是 P 值小于 0.05 且 | log?FC | 大于 1。
4. tRNA 片段（tRFs）靶基因的预测与分析：为了探究 tRFs 与信使 RNA（mRNA）的 3' 非翻译区（3’ UTRs）之间的相互作用，研究人员使用了 miRanda 和 TargetScan 这两个专业的计算工具。miRanda 通过算法评估 RNA 相互作用的可能性，设定最小自由能（MFE）阈值为 - 20 kcal/mol 来筛选潜在的功能性相互作用；TargetScan 则更注重种子序列在不同物种间的保守性，要求 tRF 的种子区域有 7 - 8 个核苷酸的匹配，同时还考虑了位点可及性和局部 AU 含量等因素来提高预测的特异性。研究人员还分析了结合位点在 3’ UTR 中的位置，重点关注终止密码子附近或 3’ UTR 中点的区域，并且使用 PhyloP 或 PhastCons 等保守性分数对这些靶位点的进化保守性进行定量评估，设定阈值为 0.6（0 - 1 分制） 。
5. tRNA 衍生片段靶基因的综合功能富集分析：在对 tRNA 衍生片段（tRFs）靶基因进行功能富集分析时，研究人员运用了复杂的生物信息学工具。他们利用基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库对 tRF 靶基因进行注释，使用 Fisher 精确检验来确定富集的显著性，设定 P 值小于 0.05 为有意义。为了纠正多重检验错误，还使用 Benjamini - Hochberg 程序对错误发现率（false discovery rate，FDR）进行调整，将 FDR 阈值设定为 0.05 。
6. 蛋白质组分析：皮肤样本在含有 4% SDS、100 mM DTT、150 mM Tris - HCl（pH 8.0）的 200 μL 缓冲液中裂解，经过匀浆、两次煮沸（每次 5 分钟）和超声处理后，离心收集上清液，用 BCA 蛋白质测定试剂盒（美国 Bio - Rad 公司产品）测量蛋白质浓度。将 200 μg 的蛋白质样本通过 FASP 方法进行消化，对肽段进行定量后，用 TMT 试剂（美国 Thermo Fisher Scientific 公司产品）进行标记，然后在 Agilent 1290 HPLC 上使用 Waters XBridge BEH130 C18 柱进行分离，最后在 Thermo Fisher Q Exactive 上进行 LC - MS/MS 分析。数据分析使用 Proteome Discoverer 2.4 和 MaxQuant 软件，设定胰蛋白酶消化，固定修饰（Carbamidomethyl，TMT6plex）和可变修饰（Oxidation，Acetyl），对长度大于等于 6 个氨基酸且错误发现率小于 1% 的肽段使用 TMT 报告离子进行定量。利用 Perseus、R 和 DAVID 等工具进行生物信息学分析，包括差异表达分析（fold - change 大于 1.20 或小于 0.83，P 小于 0.05）、聚类分析和 GO 分析 。

三、研究结果

1. 样本收集与实验设计：研究人员对之前实验的小 RNA 测序原始数据进行重新分析，结合蛋白质组学数据，进一步筛选出与羊发育相关的关键 tsRNAs 及其调控网络。
2. 测序数据质量控制分析：根据小 RNA 序列与不同类型 RNA 的比对结果进行注释，按照已知 miRNA > rRNA > tRNA > snRNA > snoRNA > 基因 > 新型 miRNA 的优先级进行标注。结果显示，样本中小 RNA 测序数据的 tRNA 序列数量在 34,800 到 119,762 之间。对 tsRNA 序列的碱基偏好性分析发现，不同长度的 tsRNA，其第一位碱基的频率有所不同。在不同类型的 tsRNA 中，trf - i 出现的频率最高，长度范围在 18 到 44 nt。从来源上看，来自精氨酸（arg）tRNA 的 tsRNAs 数量最多，超过 100 个，而来自组氨酸（his）tRNA 和苯丙氨酸（phe）tRNA 的 tsRNAs 数量最少，总共不到 20 个。
3. 样本主成分分析（PCA）：基于与 tRNA 特异性数据库（tRFdb）的比对结果计算 tsRNAs 的 Reads Count 值，共有 53,502 个 tsRNAs 成功比对。所有样本中，共鉴定出 361 个共享的 tsRNAs，没有发现仅在成熟组或新生组中特有的 tsRNAs。通过 CPM 值对 tsRNA 总 Reads 进行标准化后发现，tsRNA 在各样本中的表达水平没有异常的高或低的离群值，说明其表达稳定。Pearson 相关系数分析表明，成熟组和新生组之间 tsRNA 表达水平的差异总体较小。但主成分分析（PCA）结果显示，第一主成分（PC1）贡献率为 34%，第二主成分（PC2）贡献率为 18%，新生组和成熟组沿着 PC1 完全分开，表明两组在整体表达模式上仍存在显著差异 。
4. 差异表达 tsRNAs 的鉴定及其表达模式分析：利用 DESeq 对各样本中鉴定出的 tsRNA 表达数据进行统计分析，以 | log?FoldChange | 大于 1 且 p 值小于 0.05 为标准，鉴定出差异表达的 tsRNAs。结果发现，1 月龄时（新生组）有 19 个高表达的 tsRNAs，没有低表达的 tsRNAs。通过聚类分析，根据差异表达基因的表达模式将其分为 9 个簇，同一簇内的基因表达趋势相似。
5. 利用 tsRNAs 靶基因和差异表达蛋白构建调控网络：蛋白质组学筛选发现，1 月龄组中有 932 个高表达蛋白和 835 个低表达蛋白。对 1 月龄组低表达蛋白进行功能富集分析，发现许多与免疫和炎症相关的通路被富集，如 “免疫反应中涉及的中性粒细胞激活”“通过 MHC I 类分子进行的肽抗原加工和呈递”“应激反应中 DNA 模板转录的调控” 等。预测 1 月龄组高表达 tsRNAs 的靶基因，并与 1 月龄组低表达蛋白进行综合分析，发现只有排名靠前的差异表达 tsRNA 的靶基因与差异表达蛋白有交集，形成了一组 20 个蛋白，这些蛋白都参与线粒体代谢和应激反应通路 。

四、研究结论与讨论

本研究发现，1 月龄（幼年）和 24 月龄（成年）滩羊皮肤组织中 tsRNA 的表达模式存在明显差异。主成分分析（PCA）清晰地展示了这两个年龄组的分离，反映出组内的高相似性和组间的显著差异。这一结果与之前其他研究中发现的小 RNA 表达随年龄变化的规律相符 。

研究鉴定出 19 个在 1 月龄羔羊中表达水平显著高于成年羊的 tsRNAs，这表明 tsRNA 的表达谱在羊的发育过程中受到调控，可能在早期发育阶段的基因表达调控中发挥重要作用。蛋白质组学数据显示，1 月龄羔羊中有大量与免疫反应和炎症相关的低表达蛋白，这意味着羊的免疫系统在 1 到 24 个月龄之间经历了显著的成熟过程。将 tsRNA 数据与蛋白质组学结果相结合，揭示了 tsRNAs 与靶基因之间潜在的调控相互作用。通过预测高表达 tsRNAs 的靶基因，发现 tsRNAs 与差异表达蛋白（尤其是参与免疫和炎症反应的蛋白）之间的相互作用，暗示了一个复杂的调控网络，这个网络可能影响羊的发育过程和免疫系统的成熟 。

然而，本研究也存在一些局限性。虽然 PCA 结果显示组间存在总体差异，但组内样本之间的相关性并不高，说明新生组和成年组之间 tsRNA 表达的总体差异相对较小。此外，本研究仅反映了新生和成年羊之间 tsRNA 的表达谱，没有涉及 tRNA 表达的潜在差异，而且由于 tRNA 独特的二级结构，目前的 RNA 测序技术难以准确评估其表达，这就需要在未来的研究中开发更先进的测序方法。

尽管如此，这项研究依然具有重要意义。它让我们对 tsRNA 在羊发育过程中的表达及其作用有了更深入的理解，为后续进一步研究 tsRNA 介导的调控机制奠定了坚实的基础。未来的研究可以进一步验证这些发现，并深入探究 tsRNA 调控羊生长发育和免疫过程的具体功能机制，有望为羊的养殖和相关疾病防治带来新的突破 。