重大突破！肿瘤侵袭前沿基质机械感知如何诱导支持转移的细胞骨架与转录记忆

为解决癌细胞如何感知 ECM 特征并促进转移这一关键问题，The Breast Cancer Now Toby Robins Research Centre 等单位的研究人员，开展肿瘤侵袭前沿基质机械感知的研究，发现其诱导细胞骨架和转录记忆，为肿瘤治疗提供新思路，值得一读。

　　

来自 The Breast Cancer Now Toby Robins Research Centre Division of Breast Cancer Research, The Institute of Cancer Research 等多个单位的研究人员，其中第一作者为 Oscar Maiques，在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Matrix mechano-sensing at the invasive front induces a cytoskeletal and transcriptional memory supporting metastasis” 的论文。这篇论文在肿瘤研究领域意义重大，它深入揭示了细胞外基质（ECM，extracellular matrix）与肿瘤转移之间的复杂关系，为理解肿瘤的发展和治疗提供了新的视角和理论依据。

研究背景

肿瘤的转移是一个复杂且致命的过程，严重威胁着人类的健康。实体肿瘤由癌细胞和肿瘤微环境（TME，tumour microenvironment）组成，其中细胞外基质在肿瘤的发展和转移中起着至关重要的作用。细胞外基质主要由纤维状胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和层粘连蛋白等构成。在癌症发展过程中，细胞外基质的稳态控制被破坏，癌细胞会暴露在富含胶原蛋白的基质中。此外，细胞外基质在病理条件下会呈现出不同的组织形式，其纤维排列会影响肿瘤细胞的侵袭和转移。例如，排列整齐的细胞外基质纤维可以为肿瘤细胞的侵袭提供路径，且胶原蛋白纤维的组织形式与疾病的发生和进展相关。然而，目前对于癌细胞如何在侵袭前沿感知细胞外基质的特征，并将其转化为促进转移的信号，仍然知之甚少。

研究方法

1. 组织样本分析：研究人员结合数字病理学和图像分析技术，使用三色染色（Trichrome staining）和二次谐波产生（SHG，second harmonic generation）显微镜对黑色素瘤和乳腺癌组织样本进行研究。通过构建组织微阵列，将肿瘤区域分为肿瘤主体（TB，tumour body）、近端侵袭前沿（PIF，proximal invasive front）和远端侵袭前沿（DIF，distal invasive front），并使用 QuPath 软件评估细胞外基质组织的全局变化。
2. 细胞实验：利用多种细胞系，如黑色素瘤细胞系（4599、A375P、SKMEL28）、纤维肉瘤细胞系（HT1080）和乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）进行体外实验。通过在不同条件下培养细胞，如添加蛋白酶抑制剂（PIs，protease inhibitors）、改变胶原蛋白浓度、使用 Marangoni 流驱动的胶原蛋白凝胶等，观察细胞的形态、细胞骨架变化和侵袭能力。
3. 动物模型：使用 4599 BRAF 小鼠黑色素瘤细胞构建原位肿瘤模型，将细胞注射到小鼠真皮中，观察肿瘤的生长和转移情况。对原发性肿瘤和肺转移瘤进行组织学分析，研究细胞外基质组织、细胞骨架特征和基因表达变化。同时，进行肺定植实验，检测不同来源的癌细胞在肺中的存活和定植能力。
4. 分子生物学技术：运用 RNA 测序（RNAseq）对从肿瘤不同区域提取的细胞进行分析，研究基因表达谱的变化。通过基因富集分析（GSEA，Gene Set Enrichment Analysis）、转录因子分析等方法，探究与细胞外基质组织相关的信号通路和转录程序。此外，还使用蛋白质免疫印迹（immunoblotting）、免疫荧光（immunofluorescence）、RhoA/C-GTP 下拉实验（RhoA/C-GTP pulldown assay）等技术检测蛋白质水平和活性的变化。

研究结果

1. 实体肿瘤中细胞外基质的区域特征：研究人员通过对黑色素瘤和乳腺癌组织样本的分析发现，肿瘤主体的细胞外基质含量最低，其基质强度和各向异性也较低。而近端侵袭前沿和远端侵袭前沿的细胞外基质含量更高，纤维更长、更厚、更直，纤维间距更小且排列更紧密。在近端侵袭前沿，纤维平行于肿瘤边界排列；在远端侵袭前沿，纤维则垂直或呈放射状排列。这些结果表明，黑色素瘤和乳腺癌组织中存在相似的区域化细胞外基质组织模式，且远端侵袭前沿纤维的取向可能对癌细胞的侵袭过程起到引导作用。
2. 细胞外基质区域组织与细胞骨架重塑、局部侵袭和转移扩散的关系：研究观察到，从肿瘤主体到近端侵袭前沿再到远端侵袭前沿，细胞的圆形度和 pMLC2（MLC2 活性指标）逐渐增加，且在远端侵袭前沿观察到最高水平的变形虫样单细胞侵袭，这与最高的侵袭水平相关。在乳腺癌组织中也有类似的发现，且变形虫样侵袭的增加与黑色素瘤的疾病分期和乳腺癌的淋巴结转移相关。这说明不同的细胞外基质区域与黑色素瘤和乳腺癌的特定侵袭模式和细胞骨架重排有关，近端侵袭前沿到远端侵袭前沿区域选择了与特定基质地形、侵袭模式和淋巴结转移相关的变形虫样细胞骨架特征。
3. 细胞外基质体内组织与细胞骨架记忆的关联：在 4599 BRAF 小鼠黑色素瘤模型中，原发性肿瘤的近端侵袭前沿和远端侵袭前沿的细胞外基质组织特征与人类肿瘤相似，且远端侵袭前沿的侵袭水平更高。在转移瘤中，微转移和宏观转移的细胞外基质特征不同，但微转移和宏观转移的侵袭前沿具有相似特征。此外，从肿瘤不同区域分离的细胞在体外培养时，能够保留与原肿瘤区域相关的细胞骨架特征，如来自侵袭区域和肺转移的细胞具有更高的细胞圆形度和 pMLC2 水平。在 3D 侵袭实验和肺定植实验中，来自远端侵袭前沿的细胞表现出更强的侵袭和存活能力。这些数据表明，癌细胞能够保留与细胞外基质组织相关的细胞骨架记忆，这种记忆与转移过程中的侵袭和存活特性密切相关。
4. I 型胶原蛋白积累诱导细胞骨架重塑：在体外实验中，添加蛋白酶抑制剂可导致细胞外基质纤维的长度、宽度、直度和排列增加，纤维间距减小，从而增加基质的限制作用。这使得黑色素瘤、纤维肉瘤和乳腺癌细胞系表现出更多的变形虫样细胞骨架特征，且在器官型实验中，蛋白酶抑制剂处理后变形虫样单细胞侵袭增加。此外，增加胶原蛋白浓度也会导致类似的细胞变化，但过高的胶原蛋白浓度会因纤维较短且排列较差而降低 3D 侵袭水平。这表明 I 型胶原蛋白的积累可以诱导细胞骨架重塑，且存在一个支持侵袭的最佳胶原蛋白水平，此时纤维应更长且排列更整齐。
5. I 型胶原蛋白积累和放射状排列支持肌球蛋白 II 驱动的侵袭和转移行为：利用 Marangoni 流驱动的胶原蛋白凝胶实验发现，这种凝胶中的纤维具有更长、更厚、更直、密度更高且呈放射状排列的特点，能够模拟体内远端侵袭前沿的基质特征。在这种凝胶中培养的细胞，其肌动球蛋白活性增加，肿瘤球状体的放射状侵袭能力增强。此外，经过 Marangoni 流驱动的胶原蛋白凝胶预处理的细胞，在后续的 3D 侵袭实验和体内肺转移定植实验中，表现出更强的侵袭能力和更高的存活率。这说明细胞外基质的组织形式可以诱导细胞骨架变化，并产生一种促进侵袭和存活的细胞骨架记忆。
6. 细胞外基质组织变化导致 Rho-ROCK 激活和肌球蛋白 II 与纽蛋白解偶联：通过超分辨率旋转盘显微镜观察发现，随着胶原蛋白浓度增加或添加蛋白酶抑制剂，纽蛋白结构的整体信号和总蛋白水平下降，且在高胶原蛋白浓度或蛋白酶抑制剂处理后，肌球蛋白轻链 2（MLC2）与纽蛋白的信号比值在肌动蛋白皮层增加。同时，蛋白酶抑制剂处理后，RhoA 和 RhoC 的 GTP 水平升高，且这种变化依赖于 RhoGEF/RhoA/C/ROCK/MLC2 信号通路的激活。这些结果表明，细胞外基质积累导致纽蛋白与细胞基质粘附 / 突起解偶联，激活的 MLC2 转移到皮层，从而诱导变形虫样泡状运动行为。
7. 细胞外基质组织驱动促转移转录程序：对从肿瘤不同区域提取的 4599 黑色素瘤细胞进行 RNA 测序发现，近端侵袭前沿、远端侵袭前沿和转移瘤来源的细胞与肿瘤主体来源的细胞相比，在基因表达上存在显著差异。这些细胞共享与机械感应、细胞迁移、GTP 酶活性、变形虫样迁移、趋化性和血管生成相关的基因表达程序，且这些程序在从近端侵袭前沿到远端侵袭前沿再到转移瘤的细胞中逐渐富集。转录因子分析表明，不同区域的细胞富集了不同的转录因子，如 TEAD4 在近端侵袭前沿细胞中富集，STAT3 和炎症 / 存活相关基因以及 EMT 主调节因子在远端侵袭前沿细胞中富集。此外，通过多种实验模型证实，细胞外基质组织的变化会诱导类似的机械炎症反应，且这种反应与 HIPPO/YAP 和 NF-κB 信号通路相关。在小鼠原发性肿瘤和肺转移瘤的组织切片中，也观察到从肿瘤主体到近端侵袭前沿再到远端侵袭前沿，核 YAP、p65 和 pSTAT3 逐渐增加。这些结果表明，肿瘤中不同的转录程序会因细胞外基质的变化而在空间上被激活，这些程序通过促炎和促存活信号通路在转移级联中持续存在。
8. 细胞外基质组织诱导的转录程序与患者预后的关系：研究人员结合体外胶原蛋白模型和体内远端侵袭前沿细胞的特征，获得了一个包含 325 个基因的 “机械炎症特征”（MIS，Mechano-Inflammatory Signature）。通过空间转录组学分析发现，在人类黑色素瘤转移病灶中，MIS 在侵袭前沿上调。此外，在原发性黑色素瘤组织微阵列中，近端侵袭前沿和远端侵袭前沿的癌细胞中核 YAP1、p65 和 pSTAT3 水平更高，且远端侵袭前沿中这些蛋白阳性的癌细胞数量与黑色素瘤患者的生存时间相关，纤维排列程度也与患者生存时间相关。在多种实体瘤类型中，MIS 与较短的生存时间相关。这表明原发性肿瘤边缘的细胞外基质组织支持细胞骨架重塑和转录程序，这种程序在转移瘤中保守，且与患者预后较差相关。

研究结论与讨论

本研究通过多种先进的技术方法，深入探讨了细胞外基质组织与肿瘤转移之间的关系。研究发现，人类肿瘤可根据与肿瘤中心的距离、基质沉积、排列和纤维取向分为三个不同区域：肿瘤主体、近端侵袭前沿和远端侵袭前沿。不同区域的细胞外基质组织特征影响癌细胞的细胞骨架和行为，其中增加的基质沉积（与增加的物理限制相关）可促进细胞体收缩，导致变形虫样细胞特征，而纤维的放射状 / 垂直取向有利于最大程度的变形虫样侵袭。

研究人员还发现，癌细胞能够保留与细胞外基质组织相关的细胞骨架和转录记忆，这种记忆在转移过程中起着重要作用。转录组分析表明，细胞外基质重塑、机械感应、促存活 / 促炎和细胞骨架组织相关的基因在侵袭区域和转移瘤来源的细胞中富集。此外，研究还揭示了细胞外基质组织诱导的反应与 YAP-NF-κB 激活相关，而 STAT3 信号通路在长期维持变形虫样迁移的细胞骨架特征中起作用。

这些发现具有重要的临床意义，为肿瘤治疗提供了新的潜在靶点。例如，针对与胶原蛋白动态相关的促侵袭和促存活程序的疗法可能对具有特定肿瘤结构的患者有益。目前，泛 LOX 抑制剂（如 PXS-5505）、YAP1 抑制剂和 JAK1 抑制剂等正在进行临床前和临床试验，有望为癌症治疗带来新的突破。

总之，这项研究阐明了细胞骨架与基质的物理耦合 / 解耦如何导致长期的分子事件，从而维持有效的肿瘤转移扩散。研究结果表明，细胞外基质组织、细胞骨架特征和转录激活是癌细胞侵袭性行为的重要预测指标，为深入理解肿瘤转移机制和开发新的治疗策略提供了重要依据。