重大突破！LAT1 抗癌药物识别及氨基酸转运的结构基础全新解析

为解决 LAT1 底物和抑制剂识别机制不明的问题，德国马克斯?普朗克生物物理研究所的研究人员开展 LAT1 相关研究，解析其多种结构，明确了运输和抑制机制。该成果为抗癌药研发等提供关键依据，强烈推荐科研人员阅读。

　　

德国马克斯?普朗克生物物理研究所（Department of Structural Biology, Max Planck Institute of Biophysics）的 Yongchan Lee 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Structural basis of anticancer drug recognition and amino acid transport by LAT1” 的论文。该研究对于深入理解氨基酸转运蛋白 LAT1（L-type amino acid transporter 1，L 型氨基酸转运蛋白 1）在癌症治疗、免疫反应以及药物递送等方面的作用机制具有重要意义，为开发更有效的抗癌药物和治疗策略提供了关键的结构基础。

研究背景

氨基酸转运蛋白对于维持细胞内氨基酸稳态至关重要，它参与多种代谢和信号通路。其中，LAT1（SLC7A5）具有广泛的底物特异性，不仅能运输必需的中性氨基酸（如 L -Leu、L -Phe）、碱性氨基酸（L -His）、非必需中性氨基酸（L -Cys、L -Tyr），还能运输甲状腺激素（如和 ）、氨基酸氮芥（如美法仑，Melphalan）等大分子衍生物。这使得 LAT1 在跨细胞膜运输必需营养物质、生物分子和治疗药物方面发挥着关键作用。

由于 LAT1 在多种癌症中表达上调，其抑制剂被视为潜在的抗肿瘤药物。同时，LAT1 放射性示踪剂可用于癌症成像（正电子发射断层扫描 PET 和单光子发射计算机断层扫描 SPECT），硼化底物可用于硼中子俘获疗法（BNCT）治疗癌症。此外，LAT1 还负责将必需氨基酸、氨基酸衍生药物和前药运输穿过血脑屏障，例如用于治疗癫痫的加巴喷丁（Gabapentin）和治疗帕金森病的 L -DOPA，因此它对于营养物质和药物向大脑的递送不可或缺。

JPH203（也称为 nanvuranlat 或 KYT -0353）是一种正在进行临床试验的 LAT1 高亲和力抑制剂，对 LAT2 无明显抑制作用，在治疗多种癌症方面已展现出良好效果，并成功完成了针对胆管癌的 I 期和 II 期临床试验。2 - 氨基双环 -(2,2,1)- 庚烷 - 2 - 羧酸（2-Aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid，BCH）是一种经典的系统 L 抑制剂，对 LAT1 和 LAT2 等均有抑制作用。然而，尽管对 LAT1 的结构研究取得了一些进展，但 LAT1 如何区分底物和抑制剂（包括临床相关药物）的机制仍不清楚。此前的研究存在局限性，例如 JPH203 与纯化的 LAT1 结合的结构因洗涤剂的存在而难以确定，BCH 与 LAT1 结合的结构中配体密度弱，其抑制机制有待阐明。因此，深入研究 LAT1 与底物和抑制剂的相互作用机制迫在眉睫。

研究方法

研究人员采用脂质纳米圆盘系统（lipid nanodisc system）和冷冻电镜技术（electron cryomicroscopy，cryo -EM）对 LAT1 的结构进行研究。首先，他们将 LAT1 - CD98hc（LAT1 与单跨膜蛋白 CD98hc 形成的异二聚体复合物）纯化并重组到纳米圆盘中，添加胆固醇以维持其运输活性。为便于单颗粒分析，他们制备了小鼠单克隆抗体，筛选出能与 CD98hc 结合的 Fab170 片段用于后续研究。通过这些技术改进和样品优化，利用冷冻电镜确定了 LAT1 - CD98hc 与 JPH203 结合的结构，对跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）进行聚焦优化后，获得了配体密度更好的图谱。同时，研究人员还通过定点突变技术构建了 LAT1 的各种突变体，并利用非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes）进行放射性 L -Leu 摄取实验和逆流实验，以评估突变体对抑制剂的敏感性以及化合物的运输特性。

研究结果

1. LAT1 在脂质纳米圆盘中的结构：研究人员成功将 LAT1 - CD98hc 重组到脂质纳米圆盘中，并利用冷冻电镜在 3.9 ? 的名义分辨率下确定了其与 JPH203 结合的结构，对 TMD 的聚焦优化使局部分辨率达到 3.6 ?，为后续研究奠定了基础。
2. JPH203 与 LAT1 的结合机制：JPH203 与 LAT1 结合后，使 LAT1 呈现向外开放的构象，其 α - 羧基和 α - 氨基分别被 TM1 和 TM6 的解旋区域识别。JPH203 的 5 - 氨基 - 2 - 苯基苯并恶唑侧基未位于先前预测的 “远端口袋”，而是朝向 TM3 并部分暴露于细胞外溶剂中。其核心的二氯酪氨酸部分与 Phe252 形成 T 形 π - π 相互作用，与 Tyr259 形成卤键相互作用，同时使 TM10 产生扭结，这些相互作用扩大了底物结合口袋并将 LAT1 固定在向外开放的构象。通过比较 LAT1 和 LAT2 的氨基酸序列，发现 Ser144 和 Phe400 等残基的差异影响 JPH203 的选择性，如 LAT1 的 F400V/S144N 双突变体对 JPH203 的敏感性显著改变。此外，F252W 突变体与 JPH203 的芳香相互作用增强，使其抑制作用更强。与其他抑制剂（如 JX 系列化合物）相比，JPH203 的双卤代酪氨酸核心和庞大侧基共同作用，确保了 LAT1 的最大程度开放。
3. Phe 和 Melphalan 与 LAT1 的相互作用：研究人员确定了 LAT1 与生理底物 L -Phe 和慢底物 Melphalan 结合的结构，以及短暂孵育后获得的无配体向外开放结构。L -Phe 和 Melphalan 的结合模式与先前预测相符，L -Phe 的苯环与 Gly255 形成范德华相互作用，Melphalan 的额外双 -(2 - 氯乙基) 氨基侧基与 TM3、TM6a 和 TM10 形成更多相互作用，增加了空间位阻，限制了构象变化，这解释了 Melphalan 跨血脑屏障运输速率慢及其对氨基酸运输的抑制作用。同时，结构还表明，结构较短的 PGA（phenylglycine mustard，苯甘氨酸氮芥）在 TM10 周围产生的空间位阻较小，运输速度更快；而较大的取代基（尤其是间位取代）会增加空间位阻，增强抑制特性。
4. BCH 与 LAT1 的结合及运输机制：BCH 与 LAT1 结合后，使 LAT1 处于一种封闭状态（occluded state），这是一种之前未观察到的构象，BCH 被完全封闭在膜两侧。BCH 结合在经典的底物结合口袋中，其降冰片烷部分与 LAT1 的相互作用导致 TM10 扭曲约 70°，使 Phe400 与降冰片烷部分接触，口袋显著变窄。运输实验表明，BCH 在顺式抑制实验中抑制放射性 L -Leu 的摄取，在逆流实验中诱导 L -Leu 外流，与生理底物 L -Leu 诱导的外流相当，而 JPH203 则无此作用。这证实 BCH 是 LAT1 的可运输底物，在膜同侧与底物共存时作为竞争性抑制剂，与 JPH203 的阻断作用形成鲜明对比。
5. LAT1 运输机制中的结构重排：在图像处理过程中，研究人员发现与某些配体孵育的 LAT1 的冷冻电镜数据包含向内开放结构的粒子亚群，且结合位点为空，表明向内开放状态是低亲和力状态，有利于配体释放。而无配体时，观察到的是向内面向的粒子，这是无底物时 LAT1 的基态。结合这些粒子，研究人员获得了 3.6 ? 分辨率的无配体向内开放结构。在底物运输过程中，LAT1 的门控束（gating bundle，TM1b 和 TM6a）发生显著结构变化，如从向外开放到封闭状态转变时，TM6a 和 TM1b 向哈希结构域倾斜约 18°，Phe252 位于底物上方，封闭细胞外前庭；TM10 发生约 160° 旋转，使 Phe400 与底物直接接触。从封闭到向内面向状态转变时，TM6a 和 TM1b 进一步向内旋转，TM10 移动约 3 ?，收紧细胞外门。当处于向内开放状态时，TM1a 和 TM6b 打开，形成细胞内前庭，允许底物释放。N 末端 44 - 50 残基在向外开放和封闭构象中形成确定结构，对稳定细胞质门起重要作用，N 末端截断变体 Δ1 - 50 无运输活性。此外，还观察到胆固醇在 LAT1 - CD98hc 跨膜结构域周围的结合具有构象特异性，仅在向内开放状态下，TM9 和 TM12 之间的裂隙中结合的胆固醇密度明显，这可能解释了胆固醇在体外增强 LAT1 活性的原因。

研究结论与讨论

本研究通过结合脂质纳米圆盘系统和冷冻电镜技术，解析了 LAT1 与不同化合物结合的三种主要构象（向外面向、封闭和向内面向）的结构，描绘了其运输循环和与抑制相关的结构变化。首次从原子层面揭示了 JPH203 的作用机制，它利用 LAT1 底物结合口袋的动态特性，将其氨基 - 苯基苯并恶唑部分楔入 TM10 的柔性区域，阻止 Phe400 旋转进入底物结合口袋，使 LAT1 锁定在向外开放状态，从而阻断底物进入。阐明了经典系统 L 抑制剂 BCH 作为真正底物诱导反向转运的结构机制，其降冰片烷部分与 LAT1 的相互作用导致口袋收紧，与 JPH203 引起的口袋扩张形成鲜明对比，这凸显了 LAT1 在配体识别中的结构灵活性，为设计具有更好运输性或更强抑制性的化合物提供了策略依据。同时，揭示了美法仑等化疗药物的识别机制，其运输速率慢可能与封闭口袋过窄无法容纳有关，运输过程可能涉及 “松散” 的封闭状态或 “远端口袋” 的作用。

此外，研究发现 LAT1 的向内开放状态不利于配体结合，这与之前报道的功能不对称性一致，即细胞内底物的亲和力比细胞外底物低约 1000 倍。向外开放状态下，Phe252 翻转向上，疏水口袋更广泛地暴露于溶剂中，准备接受细胞外底物，这种不对称机制有助于 LAT1 维持细胞内氨基酸稳态。研究还证实了脂质分子与 LAT1 的结合，胆固醇在向内开放状态下与 TM9 - TM12 裂隙的特异性结合，以及磷脂与异二聚体的稳定结合，表明脂质在 LAT1 的结构稳定和构象变化中起重要作用，脂质暴露的瞬时形成口袋可能成为转运体变构调节的潜在靶点。

总的来说，该研究为理解 LAT1 的氨基酸运输和抑制机制提供了坚实的结构基础，为设计针对系统 L 的可运输或不可运输药物绘制了蓝图。脂质纳米圆盘系统的应用为进一步研究 LAT1 的结构和生化特性带来了新的希望，有望推动癌症治疗和药物研发领域的发展，为攻克癌症等重大疾病提供新的思路和方法。