重大突破！用于按需生产治疗性蛋白质的硝酸甘油响应性基因开关全新问世

为解决基因和细胞疗法中精确调控治疗性蛋白生产的难题，ETH Zurich 的研究人员开展硝酸甘油响应性基因开关的研究。他们构建 hNORM 系统，在小鼠实验中有效治疗 2 型糖尿病。该成果为慢性病治疗带来新希望，值得科研人员阅读。

　　

来自 ETH Zurich（瑞士联邦理工学院苏黎世分校）的 Mohamed Mahameed、Shuai Xue 等研究人员在《Nature Biomedical Engineering》（《自然生物医学工程》）期刊上发表了题为 “Nitroglycerin-responsive gene switch for the on-demand production of therapeutic proteins”（用于按需生产治疗性蛋白质的硝酸甘油响应性基因开关）的论文。该研究成果在基因治疗和细胞治疗领域意义重大，有望推动安全、便捷且响应性良好的植入式设备的发展，为慢性病的治疗带来新的希望 。

研究背景

随着基因疗法和细胞疗法逐渐成为现代个性化医学的重要支柱，开发高效的基因开关至关重要。这些基因开关需要能以稳健、可靠且可调的方式，实现生物制药的原位动态生产和全身递送，同时最大程度地方便患者并提高其依从性。此前，虽然已有多种触发化合物和物理信号被用于刺激蛋白质药物释放，但现有的基因开关仍存在诸多问题。例如，一些触发化合物生物利用度有限、具有多效性副作用，而物理信号控制方式可能需要高能量输入，还可能涉及具有副作用、生物利用度差或半衰期短的非生理性化学或无机辅助因子。因此，开发一种由安全、方便、临床许可的小分子化合物驱动的完全人源化基因开关迫在眉睫。

在这样的背景下，研究人员将目光聚焦在硝酸甘油（Nitroglycerin，NG）上。NG 作为一种血管扩张剂，已被广泛用于治疗心绞痛和慢性心力衰竭等心脏疾病长达 130 多年，其通过转化为一氧化氮（Nitric Oxide，NO）发挥治疗作用。NO 是一种气态信号分子，参与多种重要的生物过程，但其直接给药存在困难，如气态不易精确给药、半衰期短等。而 NG 经皮给药后几乎能完全被吸收，且 NG - 透皮贴剂已成为治疗心绞痛的标准方法。基于此，研究人员希望利用 NO 和 NG 的特性，设计一种完全人源的一氧化氮响应性转基因调控方式（hNORM），推动 NG 在基因和细胞治疗领域的应用。

研究方法

1. 构建 hNORM 系统：hNORM 系统利用人线粒体乙醛脱氢酶 2（ALDH2）将经皮递送的 NG 高效转化为 NO。为使其他人类细胞具备 NO 信号传导能力，研究人员引入了人源含亚铁血红素的可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），其由 α 和 β 亚基组成，可在 NO 的作用下催化生成第二信使环磷酸鸟苷（cGMP）。此外，还引入了人 cGMP 依赖性蛋白激酶 G1（PKG1），它能放大 cGMP 信号并磷酸化 cAMP 反应元件结合蛋白（CREB），进而激活含有 cAMP 反应元件（CRE）的合成启动子，实现 NG 触发的 NO 感知与转基因表达的关联。
2. 细胞实验：在多种哺乳动物细胞系中，研究人员共转染相关质粒，监测报告基因的表达，以评估 hNORM 系统的性能。例如，在 HEK - 293 细胞中，通过转染 pMMH178、pMMH179 和报告质粒 pCK53，利用 NO 供体 DETA NONOate 和 SNAP 等处理细胞，检测分泌型胎盘碱性磷酸酶（SEAP）的水平，以此判断系统对 NO 的敏感性 。
3. 动物实验：将微囊化的 hNORM 转基因人细胞皮下植入小鼠体内，在植入部位上方贴上临床许可的 NG 透皮贴剂，监测目标蛋白的产生和全身递送情况。为验证 NO 介导的体内 hNORM 控制，研究人员使用表达不同蛋白的稳定细胞系进行实验，如表达纳米荧光素酶（NLuc）的细胞系和表达胰高血糖素样肽 - 1（GLP - 1）的细胞系，并检测血液中相关蛋白的水平、血糖、血压、心率等生理指标 。

研究结果

1. hNORM 在哺乳动物细胞中的性能
   • 研究人员最初在 HEK - 293 细胞中测试 NO 对 hNORM 系统的影响时发现，仅转染 sGC 相关质粒时，NO 供体无法在 24 小时内触发 SEAP 表达，表明该基本系统对 NO 不够敏感。
   • 当共转染 PKG1 后，NO 供体 DETA NONOate 和 SNAP 能诱导大量 SEAP 表达，说明 PKG1 的共表达促进了 sGC 介导的 NO 感知，并放大了 cGMP 的产生，对 hNORM 系统的功能至关重要。
   • 进一步研究发现，该系统在多种人源和啮齿动物源的不同组织细胞系以及原代人真皮成纤维细胞中均表现出强大的 NO 诱导 SEAP 表达的能力。其中，HEK - 293 细胞效果最佳，因此研究人员构建了稳定表达相关组件的转基因 HEK - 293 细胞系。
   
   
2. 线粒体 ALDH2 对 hNORM 体内性能的影响
   • 研究人员使用局部 NG 透皮贴剂替代 NO 供体，发现不同大小和 NO 含量的 NG 透皮贴剂（Deponit 10）能够精确控制皮下植入的微囊化 hNORM 转基因细胞产生和全身递送目标蛋白 。
   • 为确保 NG 在体内能高效转化为 NO，研究人员构建了额外组成性表达 ALDH2 的细胞系。实验表明，使用细胞系替代细胞系，可使 hNORM 系统中 NLuc 的诱导倍数增加三倍以上，且提高了皮肤组织中 NO 的含量，证明 ALDH2 工程有效增强了 hNORM 对 NG 的敏感性和整体体内性能。
   
   
3. 稳定 hNORM 转基因人细胞系的生成和表征
   • 研究人员利用睡美人转座酶（SB）系统，构建了稳定共表达 sGC、PKG1 和驱动的 NLuc 的单克隆细胞系。该细胞系具有极低的泄漏性和强大的转基因诱导能力（135 倍，半最大有效浓度约为 75 μM），且转基因表达具有良好的可逆性，在蛋白和 mRNA 水平均得到验证。
   • 同时，细胞在 NO 供体 DETA NONOate 的调节有效浓度下保持高活力，无明显细胞毒性。此外，sGC 抑制剂亚甲蓝可剂量依赖性地抑制 NO 触发的 hNORM 介导的转基因表达，为 hNORM 提供了可调节的双药输入控制，也可作为紧急情况下重置 hNORM 的安全开关。
   
   
4. hNORM 在小鼠体内的可逆性和局部作用特性
   • 由于 NG 半衰期短，研究人员推测将 NG 透皮贴剂尽可能靠近植入部位放置，可减少 hNORM 控制所需的有效剂量，降低全身 NG 水平，提高特异性并减少多效性副作用。实验结果证实，远离皮下植入部位放置 NG 透皮贴剂或腹腔植入细胞的小鼠，血液中未检测到 NLuc，表明 hNORM 对 NG 透皮贴剂具有特定的短距离响应性，且对深部组织影响较小。
   • 通过在小鼠皮下植入微囊化细胞，并每隔 24 小时交替应用和移除 NG 透皮贴剂，同时监测血液中 NLuc 水平，发现血液中 NLuc 水平在应用 NG 透皮贴剂后 24 小时内达到最大值，移除贴剂后下降，连续进行六次应用和移除循环，结果表明 hNORM 在体内具有良好的可逆性、稳健性和可靠性。
   
   
5. NG - 透皮贴剂控制的 GLP - 1 表达对实验性 2 型糖尿病的治疗效果
   • 研究人员构建了稳定转基因的单克隆细胞系，该细胞系可在 NO 触发下产生 GLP - 1。体外实验显示，细胞在 NO 供体 DETA NONOate 处理后，GLP - 1 诱导倍数近 40 倍，且产生的 GLP - 1 具有生物活性。
   • 将微囊化的细胞皮下植入 2 型糖尿病小鼠体内，发现 NG 透皮贴剂能剂量依赖性地诱导 GLP - 1 分泌，130 μg/24 h 的 NG 透皮贴剂足以诱导 GLP - 1 分泌。
   • 对植入细胞并接受 NG 透皮贴剂治疗的 db/db 小鼠进行 35 天的监测，结果显示，治疗组小鼠血液中 GLP - 1 水平显著升高，血糖水平在整个治疗期间恢复正常，且平均动脉血压（MAP）和心率未受影响，表明该治疗方法无心血管副作用。进一步研究发现，细胞过表达 ALDH2，可在 NG 进入血液循环前将其代谢，从而避免了 NG 对心血管系统的影响。
   
   
6. hNORM 调控的 GLP - 1 释放对 2 型糖尿病小鼠代谢的影响：持续 35 天用临床许可的 NG 透皮贴剂治疗植入细胞的 2 型糖尿病小鼠后，研究发现 hNORM 使小鼠全身胰岛素水平正常化，体重恢复到正常水平，长期血糖稳态得以恢复，胰岛素抵抗消除。葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验也证实了慢性胰岛素抵抗和高血糖的逆转，治疗后的小鼠表现出正常的餐后血糖控制和胰岛素反应动态。

研究结论与讨论

本研究成功开发了 hNORM 系统，该系统利用临床许可的 NG 透皮贴剂，实现了对治疗性蛋白质原位生产和实时全身给药的精确、可逆和动态控制。在 2 型糖尿病小鼠模型中，hNORM 系统通过调控 GLP - 1 的表达，有效恢复了血糖稳态，且未对心血管系统产生不良影响。这一成果为基因和细胞治疗提供了一种创新的调控方式，具有诸多优势。

首先，hNORM 系统完全由人源控制组件组成，可最大程度降低免疫反应风险，实现与细胞代谢的无缝整合，并确保生理兼容的控制动力学。其次，NG 透皮贴剂给药方便、无创、精确且可按需进行，有望提高患者的治疗依从性和生活质量，同时也有利于细胞治疗的工业化生产。此外，NG 透皮贴剂成本低、易于获取且储存要求简单，与需要反复注射和严格储存条件的昂贵 GLP - 1 类似物形成鲜明对比。

然而，该研究目前仍处于概念验证阶段，要将其转化为人类应用，还需进一步研究。例如，需要仔细探索用于人类的细胞来源和性质，因为 HEK - 293 细胞目前尚未获得临床许可用于人体。另外，还需研究植入物在人体内的长期稳定性，由于物种间细胞外和降解酶的差异以及环境因素的影响，在小鼠实验中观察到的藻酸盐 - PLL - 藻酸盐微胶囊在植入 35 天后的稳定性，在人体中还需进一步确认。同时，在人体应用中，还需谨慎选择植入部位，并评估植入物在正常运动和身体活动条件下的稳定性。

尽管如此，hNORM 系统为治疗慢性疾病提供了一种有前景的药物递送方法，有望改变目前依赖侵入性和频繁注射的治疗模式。未来，随着相关研究的不断深入，hNORM 系统有望在个性化细胞治疗中发挥重要作用，为更多患者带来新的治疗选择 。