重大突破！揭秘 ARPKD 大鼠模型囊肿液电解质与代谢物组成，为多囊肾病诊疗开辟新方向

为解决多囊肾病（PKD）治疗难题，美国南佛罗里达大学研究人员开展 ARPKD 大鼠模型囊肿液成分研究。结果发现其有独特离子组成和性别差异代谢物谱。该研究为 PKD 治疗提供新思路，值得科研人员一读。

　　

美国南佛罗里达大学（University of South Florida）的 Christine A. Klemens 等人在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Electrolyte and metabolite composition of cystic fluid from a rat model of ARPKD” 的论文。该研究对多囊肾病（Polycystic Kidney Disease，PKD）领域意义重大，有助于深入了解疾病的病理生理学机制，为开发潜在的饮食或药物干预措施、延缓疾病进展提供了重要依据。

多囊肾病是一种具有破坏性的遗传性肾脏疾病，是导致肾衰竭的重要原因。其主要特征为肾脏中出现大量充满液体的囊肿，这些囊肿会随着时间不断增大，进而损害周围组织，最终往往需要进行肾脏替代治疗。PKD 主要分为常染色体显性多囊肾病（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease，ADPKD）和常染色体隐性多囊肾病（Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease，ARPKD）两种类型。ADPKD 主要由 PKD1 和 PKD2 基因突变引起，通常在成年期发病。已有研究表明，男性患者的疾病进展相对更快，但背后的原因尚不明确。ARPKD 则较为罕见，然而其疾病进展更为严重，多在围产期或儿童期发病，它是由 PKHD1 基因突变导致的，该基因编码纤维囊蛋白（fibrocystin，也称为多管蛋白 polyductin ）。目前，针对 ADPKD 仅有托伐普坦（Tolvaptan）这一种治疗药物，且其存在多尿、烦渴和潜在肝毒性等不良反应；而针对 ARPKD，临床上尚无有效的治疗手段（尽管托伐普坦正在进行针对 ARPKD 的临床试验 ）。

由于囊肿的形成是 PKD 的主要特征，因此研究人员一直致力于探究囊肿液的成分。此前的研究发现，ADPKD 患者囊肿内的离子浓度存在异质性和可变性。一般来说，与近端肾小管段相关的囊肿，其离子浓度与间质空间相似（高 Na?、高 Cl?、低 K? ）；而远端囊肿的离子平衡则相反，Na?（2 - 50 mM）和 Cl?（0 - 55 mM）浓度较低，K?（5 - 58 mM）浓度较高。同时，近端和远端囊肿的渗透压约为 300 mOsm，但远端囊肿的渗透压计算存在 50 - 100 mOsm 的间隙，可能由氨基酸来补偿。此外，还有研究通过核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）光谱或蛋白质组学对囊肿液环境进行了进一步研究，发现囊肿液中存在多种大分子和低分子量化合物，包括氨基酸、糖类、多元醇以及有机酸和碱等。随着组学时代的到来，众多研究开始关注 PKD 患者或啮齿动物模型的血浆、尿液和肾脏组织的代谢组学组成，旨在寻找疾病严重程度和进展的生物标志物，识别疾病进展过程中的病理生理代谢紊乱，并探索可作为治疗靶点的异常代谢途径。然而，此前尚未有关于 PKD 啮齿动物模型囊肿液离子浓度的报道。

在本研究中，研究人员选用了一种自发突变的 ARPKD 大鼠模型 ——PCK 大鼠，该模型的 Pkhd1 基因发生突变，与人 ARPKD 致病基因同源。PCK 大鼠不仅会出现肾脏囊肿，还会伴有肝脏囊肿，且雄性大鼠在约 18 周龄时肾脏损伤会比雌性大鼠更为严重，其囊肿主要起源于集合管，这与人类 ARPKD 患者的情况相似。研究人员以此模型为研究对象，旨在消除 ADPKD 模型中可能存在的囊肿异质性，并比较雄性和雌性 PCK 大鼠在雄性肾脏与体重比显著恶化之前囊肿液成分的差异，进而确定可能对雄性有害或对雌性有保护作用的化合物或代谢途径。

研究人员采用了一系列先进的技术方法。在样本采集方面，他们从 10 - 12 周龄的雄性和雌性 PCK 大鼠的腹主动脉采集血液，从膀胱直接收集尿液，并使用 U100 注射器通过微穿刺从灌注 PBS 的多囊肾中收集囊肿液，所有样本在采集后立即速冻。在分析方法上，运用了多种技术：通过血气血分析仪 ABL800FLEX 测量尿液、血液和囊肿液中 Na?、K?、Cl?、Ca2?、葡萄糖和肌酐的浓度，利用冰点下降法测定渗透压；采用非靶向代谢组学技术，结合四极杆飞行时间质谱（Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry，Q-TOF MS）和高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）对囊肿液中的化合物进行分离和鉴定，并通过主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和统计分析来评估雄性和雌性之间的差异；进行转录组分析，对用于非靶向代谢组学的雄性和雌性 PCK 大鼠的肾皮质组织进行 RNA 测序（RNA-Seq），以确定性别差异对囊肿液代谢谱的影响；运用联合通路分析，将代谢组学和转录组学数据相结合，进一步描绘雄性和雌性 PCK 大鼠之间不同的代谢途径；通过靶向代谢组学方法，直接定量测定囊肿液、血浆和尿液中 42 种氨基酸的浓度 。

研究结果

1. PCK 大鼠囊肿液具有独特的离子组成：研究人员对比了 PCK 大鼠囊肿液、尿液和血浆中的离子浓度，发现 10 - 12 周龄时，雄性和雌性 PCK 大鼠的双肾与体重比并无显著差异，囊肿液或血浆中的溶质浓度及渗透压也不存在性别差异。不过，囊肿液的渗透压相较于尿液显著降低（431 ± 12 vs 1215 ± 99 mOsm，p 值 < 0.0001），且与人类囊肿液的报道值较为接近。在离子浓度方面，囊肿液中 Na?和 Cl?浓度明显低于血浆和尿液，K?浓度显著高于血浆但低于尿液，Ca2?浓度低于血浆但与尿液无差异。此外，囊肿液中的葡萄糖浓度明显低于血浆（非禁食状态）但高于尿液，肌酐浓度则高于血浆但低于尿液。
2. 雄性和雌性 PCK 大鼠囊肿液的代谢组学分析：对囊肿液进行非靶向代谢组学分析后发现，在初始鉴定中，共检测到 6910 个质量峰。PCA 图清晰地显示，雄性和雌性样本可分为不同的组，且组内具有相似性。与雄性相比，雌性中有大量的峰显著上调（1305 个）或下调（1214 个），还有 253 种化合物仅在雌性中存在，210 种仅在雄性中存在。通过代谢分析软件 Metaboanalyst Peaks to Pathways 6.0 评估关键代谢途径后发现，雄性和雌性之间差异显著的途径包括精氨酸生物合成、色氨酸代谢、叶酸生物合成以及烟酸和烟酰胺代谢等，且鉴定出的代谢物大多为氨基酸或肽片段。
3. 雄性和雌性 PCK 肾脏组织的转录组分析：对雄性和雌性 PCK 大鼠肾皮质组织进行 RNA-Seq 分析，结果显示，当调整后的 P 值截止为 0.05 且 log2 倍数变化截止 > 1 时，雌性中有 170 个基因上调，198 个基因下调 。通过 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析发现，这些差异表达基因与多种分子和细胞功能、基因本体（Gene Ontology，GO）通路以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路相关。IPA 还确定了一个关键的信号网络，涉及囊性纤维化跨膜调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator，CFTR）、Notch、Rac、Vegf、S100A8、Hif1 等，其中这些基因的表达和下游活动在雌性中预计较弱。
4. 集合管中关键离子通道的比较：已知肾单位中的离子通道和转运体存在明显的性别差异，且一些关键通道的活性可能与囊肿形成有关。研究人员评估了集合管中与囊肿生长相关的离子通道的归一化基因计数（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads，FPKM），发现许多关键通道转录本在雄性和雌性之间存在显著差异，如 α - 和 β - ENaC 亚基（α Scnn1a 和 β Scnn1b）、ROMK（Kcnj1）、K?内向整流通道（K? inwardly rectifying channels，K?ir 4.1（Kcnj10）、K?ir 5.1（Kcnj16））、AQP2、CFTR、TMEM16A 以及离子嘌呤能受体 P2rx7 等。通过蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测 K?ir 5.1 的蛋白质水平，发现 PCK 雌性大鼠中该蛋白水平显著增加，与转录表达水平相符。
5. 代谢组学和转录组学数据的联合通路分析：联合通路分析结果显示，色氨酸代谢、药物代谢、类固醇激素生物合成和脂肪酸代谢等是雄性和雌性 PCK 大鼠之间差异显著的主要途径。色氨酸代谢通过吲哚途径、血清素途径和犬尿氨酸途径进行，在这三条途径中，雄性和雌性之间有多种化合物存在显著差异。进一步研究发现，参与色氨酸代谢的 Aadat、Ahr、Inmt、Kmo 和 Tdo2 基因的表达在雄性和雌性之间也存在显著差异。
6. 囊肿液中氨基酸浓度的定量分析：研究人员对囊肿液、血浆和尿液中的氨基酸浓度进行了定量分析。结果表明，囊肿液中含量最丰富的前 5 种氨基酸依次为牛磺酸（Taurine）、谷氨酸（Glutamic Acid）、甘氨酸（Glycine）、丙氨酸（Alanine）和赖氨酸（Lysine）。与血浆和尿液相比，共有 22 种氨基酸在囊肿液中的浓度显著升高。在性别差异方面，囊肿液中仅有 1 - 甲基组氨酸（1-Methylhistidine）、3 - 甲基组氨酸（3-Methylhistidine）、乙醇胺（Ethanolamine）和牛磺酸这 4 种氨基酸存在性别差异，其中牛磺酸在囊肿液中的浓度极高，是第二丰富氨基酸的 5 倍多。与 SD 大鼠相比，PCK 大鼠血浆中的牛磺酸浓度显著降低，而尿液中的牛磺酸浓度则大幅增加 。

研究结论与讨论

本研究对 PCK 大鼠囊肿液的离子浓度和代谢物谱进行了深入研究，发现该模型的囊肿液具有独特的离子浓度梯度，且代谢物谱存在性别差异。与人类 ADPKD 远端囊肿相比，PCK 大鼠囊肿液中的 K?浓度更高，Na?浓度处于人类检测范围的中间值，Cl?浓度略高于人类报道的最大值。这些离子浓度的差异可能会影响离子驱动的转运过程和细胞信号传导，进而对囊肿的形成和发展产生影响。虽然研究未发现囊肿液离子浓度的性别差异，但在一些集合管转运体的 mRNA 表达上存在显著的性别差异，这些差异可能对雌性具有保护作用。例如，CFTR 和 TMEM16A 被认为是负责将氯离子分泌到囊肿中的主要转运体，而雌性 PCK 肾脏中这两种蛋白的转录本显著减少；同时，雌性大鼠中 α - 和 β - ENaC 亚基的表达增加，可能有助于防止液体在体内积聚。

研究还发现，PCK 大鼠囊肿液中脂肪酸氧化减少和脂质代谢失调，这与此前关于多囊肾的研究结果一致。此外，色氨酸代谢在雄性和雌性之间存在显著差异，这一发现与其他研究中色氨酸代谢与 PKD 疾病进展相关的结论相呼应。例如，在 ADPKD 模型小鼠中，色氨酸代谢物与疾病进展密切相关，敲除关键的色氨酸代谢酶 IDO1 可降低囊肿指数和肾脏与体重比。

值得注意的是，本研究中最意外的发现是 PCK 大鼠囊肿液和尿液中含有高浓度的牛磺酸。虽然此前的代谢组学研究已将牛磺酸与尿液中的囊性疾病联系起来，但在本研究的模型中，牛磺酸在囊肿液中的积累可能会通过溶质拖拽作用促进囊肿生长。尽管牛磺酸在体内具有多种重要功能，如调节细胞体积、稳定细胞膜、形成胆汁盐和清除自由基等，但在 PKD 的背景下，其在囊肿液中的积累可能具有潜在的危害。由于囊肿液中低 Na?和 Cl?浓度会降低顶端牛磺酸转运体（TauT）的活性，使得牛磺酸更容易在囊肿液中积聚，难以重新进入细胞。

从临床角度来看，本研究结果对 PKD 患者的潜在饮食干预和治疗靶点具有重要意义。例如，血浆牛磺酸水平与 ADPKD 患者的囊肿负担呈负相关，且在人类 ADPKD 的单细胞 RNA 测序数据中，TauT mRNA 的表达在多种细胞类型中发生了显著变化，这进一步支持了研究牛磺酸转运和代谢在 PKD 中的重要性。如果饮食中的牛磺酸是促进囊肿形成的环境因素，那么临床医生可以建议患者避免食用富含牛磺酸的食物和补充剂，如贝类和能量饮料。此外，由于色氨酸代谢与疾病进展相关，针对该代谢途径的干预措施也可能成为潜在的治疗方向。

综上所述，本研究深入剖析了 ARPKD 大鼠模型囊肿液的成分，揭示了其离子浓度、代谢物谱的特征以及性别差异，为理解 PKD 的病理生理学机制提供了新的视角，也为开发潜在的治疗策略和饮食干预措施奠定了基础，有望为 PKD 患者带来新的希望，帮助减缓疾病的进展，改善患者的生活质量和预后。