深度解析粪便源细胞外囊泡蛋白质组景观在结直肠癌前病变及癌症中的关键意义

为解决结直肠癌（CRC）早期诊断难题，美国梅奥诊所研究人员开展粪便源细胞外囊泡（EVs）蛋白质组研究。结果揭示其蛋白质组景观等。这为 CRC 早期诊断生物标志物开发提供关键依据，强烈推荐科研读者阅读。

　　

美国梅奥诊所（Mayo Clinic）的研究人员 Emmalee J. Northrop - Albrecht、Yohan Kim 等人在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “The proteomic landscape of stool - derived extracellular vesicles in patients with precancerous lesions and colorectal cancer” 的论文。这篇论文在结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）早期诊断及生物标志物研究领域具有重要意义，为后续相关研究提供了关键的理论依据和研究思路。

一、研究背景

结直肠癌是美国第二大致命癌症，然而若能早期发现，其治愈率较高。目前，多靶点粪便 DNA（multitarget stool DNA，mt - sDNA）检测虽对结直肠癌有较高的检测率，但在检测晚期癌前病变时敏感性仅为 43%。细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）作为一种潜在的生物标志物来源，有望提高对晚期癌前病变的检测能力，进而改善结直肠癌的预防现状。

细胞外囊泡是由所有活细胞分泌到细胞外环境中的小颗粒（约 30nm 至 10μm），其被磷脂双层包裹，含有核酸、蛋白质、脂质和代谢物等，在细胞间通讯中发挥着重要作用。目前已有多种技术可用于从可溶性成分中分离细胞外囊泡，如差速离心、密度梯度离心、超滤（Ultrafiltration，UF）、尺寸排阻色谱法（Size - exclusion chromatography，SEC）、免疫捕获和基于聚合物的沉淀等，但针对粪便来源的细胞外囊泡的分离和表征研究较少，且缺乏标准化的分离方法。此前研究虽对从人类粪便标本中分离 / 富集细胞外囊泡的方法进行了比较，但超滤分子量截断值（Molecular weight cut - off，MWCO）对粪便上清液中细胞外囊泡回收和纯度的影响尚未明确。此外，粪便细胞外囊泡的蛋白质组景观也未得到充分探索，不同研究在疾病类型、细胞外囊泡分离方法和蛋白质检测应用等方面存在差异。

二、研究方法

1. 样本采集：本研究经梅奥诊所机构审查委员会批准，并获得患者知情同意。浓度方法比较的粪便标本来自无癌个体，从梅奥诊所罗切斯特明尼苏达州的前瞻性登记档案中获取；用于蛋白质组学研究的较大队列患者的粪便标本在 2018 - 2023 年收集。此外，还收集了胰腺汁样本作为检测粪便中胰腺酶的阳性对照。
2. 细胞外囊泡分离与浓缩：粪便上清液先经 13,000×g 离心 3 分钟去除细胞碎片，然后使用尺寸排阻色谱法（SEC；qEV1/35nm & 70nm，IZON Science）按照制造商说明分离细胞外囊泡。SEC 分离后的部分（F7 - F11；3.5ml）再通过超滤（使用截留分子量为 10kDa、30kDa、50kDa 或 100kDa 的 Amicon ultra - 4ml 和 15ml 再生纤维素离心过滤装置）或速度真空（Speed vacuum，SV）进行浓缩。
3. 检测与分析技术：利用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy）观察细胞外囊泡的形态和纯度；纳米流式细胞术（Nanoscale Flow Cytometry，nFCM）和微流控电阻脉冲传感（Microfluidic Resistive Pulse Sensing，MRPS）用于测定回收率和颗粒大小分布；RNA 提取和分析用于研究 RNA 组成；蛋白质浓度测定采用 Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒；样本经处理后，通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）在高分辨率 Orbitrap Exploris 480 质谱仪上进行分析；蛋白质鉴定和生物信息学分析使用 Peaks X Pro、MaxQuant 等软件，并与多个数据库进行比对。此外，还运用了蛋白质免疫印迹法（Western blot）和斑点印迹法（Dot blot）对特定蛋白质进行检测和分析。

三、研究结果

1. 浓度方法对粪便细胞外囊泡蛋白质和 RNA 特征的影响：通过透射电子显微镜观察发现，随着超滤分子量截断值增加，可见污染物似乎减少，速度真空法制备的样品虽含有完整的细胞外囊泡，但可见污染物比 UF - 100kDa 略多。纳米流式细胞术显示，Izon 的 35nm 和 70nm SEC 柱的回收率无差异，且 15ml 离心过滤器的超滤回收率显著高于 4ml 离心过滤器。MRPS 测量结果表明，不同浓度方法的 SEC 回收率和总颗粒回收率存在差异，速度真空法的 SEC 后回收率优于 UF - 100kDa。经酶处理后，囊泡 RNA 占比在 8% - 43% 之间，表明大部分 RNA 来自非囊泡，且速度真空法的 RNA 产量高于 UF - 50kDa。蛋白质产量与超滤柱的 MWCO 呈负相关，速度真空法的蛋白质产量最高，但可溶性蛋白质污染比 UF - 30kDa 和 UF - 50kDa 更高。
2. 粪便细胞外囊泡制备物的人类蛋白质组景观：利用质谱分析发现，不同浓度方法对粪便细胞外囊泡制备物的蛋白质组成影响不大，在不同患者或同一患者的不同浓度方法中，EV 标记物的丰度无差异。在较大队列中，共检测到 363 种独特的人类蛋白质，平均每个样本检测到 88 ± 27 种。功能富集分析表明，这些蛋白质与消化、中性粒细胞聚集 / 趋化和防御反应等生物过程相关。此外，通过比较细胞外囊泡制备物和可溶性蛋白质丰富的部分，发现一些蛋白质可作为粪便细胞外囊泡分离纯度的标记物，如分泌的蛋白酶抑制剂和肝脏来源的可溶性蛋白质在可溶性蛋白质部分含量高，而在细胞外囊泡制备物中含量大幅降低；相反，分泌的胰腺水解酶 CTRC 和 CELA3A 在细胞外囊泡部分含量较高。
3. 高丰度胰腺来源的酶原颗粒在粪便细胞外囊泡制备物中共分离：研究发现粪便细胞外囊泡样本中水解酶含量丰富，其中许多水解酶由胰腺分泌。通过多种实验证实，含有丰富酶的酶原颗粒在粪便细胞外囊泡制备过程中可能与细胞外囊泡共分离，如通过蛋白质免疫印迹法和斑点印迹法检测到酶原颗粒相关蛋白 CELA3A 和 GP2 的存在，且 GP2 在粪便和胰液中的表达和浓度存在差异。此外，对胰蛋白酶和半胰蛋白酶消化的肽段进行分析表明，高浓度的胰腺蛋白酶不会影响细胞外囊泡相关蛋白质的质谱分析。
4. 粪便来源的细胞外囊泡蛋白质组中可检测到结肠富集和特异性蛋白质：对经 SEC 和 UF - 10kDa 分离的样本进行分析，发现了与结肠、小肠、胰腺和食管相关的蛋白质，其中有 10 种结肠富集的蛋白质位于细胞表面。在较大队列中，也检测到 15 种结肠富集的蛋白质，这些蛋白质主要位于质膜，功能相互作用网络显示它们之间关系密切。通过蛋白质免疫印迹法和纳米流式细胞术进一步验证了部分结肠富集表面蛋白的存在，如 CEACAM5，其阳性的细胞外囊泡在粪便中的浓度和占比也被检测出来。
5. 粪便细胞外囊泡制备物具有更多样化的细菌蛋白质组，但人类来源的蛋白质更丰富：在浓度方法比较队列中，检测到大量细菌蛋白质，不同样本和浓度方法中细菌蛋白质的种类和数量存在差异。虽然细菌蛋白质组更加多样化和复杂，但人类来源的蛋白质在粪便中的丰度更高。去除前四种高丰度分泌蛋白后，人类总蛋白丰度和中位数倍数差异显著下降。此外，还检测到来自食物的蛋白质。

四、研究结论与讨论

本研究全面分析了粪便来源的细胞外囊泡的蛋白质组，验证了尺寸排阻色谱法和超滤相结合的方法可用于分离粪便来源的细胞外囊泡，且具有可接受的回收率和纯度。研究确定了粪便来源的细胞外囊泡的组织起源及其在总细胞外囊泡群体中的相对贡献，揭示了胰腺和唾液酶原颗粒以及中性粒细胞胞外陷阱在粪便细胞外囊泡制备物中的共分离现象，并鉴定出几种结肠来源的细胞外囊泡的表面标记物，这些标记物有望作为分离组织特异性细胞外囊泡的靶点。

然而，本研究也存在一些局限性。例如，浓度方法比较数据集的高丰度人类衍生蛋白质可能限制了对低表达生物相关蛋白质的检测；超滤 MWCO 的比较研究仅在两个患者样本上进行，虽未观察到明显差异，但样本量较小限制了统计分析和结论的可靠性；此外，研究未对粪便来源的细胞外囊泡进行转录组分析。

尽管如此，该研究为未来粪便细胞外囊泡生物标志物在结直肠癌及其他胃肠道恶性肿瘤中的发现提供了重要框架。其成果有助于进一步理解肠道微生物群与宿主的相互作用以及对病理生理过程的影响，为开发更敏感、更特异的结直肠癌早期诊断工具奠定了基础。后续研究可在扩大样本量、深入开展转录组分析等方面展开，以进一步挖掘粪便细胞外囊泡在癌症诊断和治疗中的巨大潜力。