耐力运动重塑骨骼肌新机制：抑制 Ythdf1 介导的肌肉生长抑制素表达

为探究耐力运动诱导骨骼肌重塑的机制，深圳大学医学院等单位的研究人员开展相关研究，发现耐力运动抑制 Ythdf1，进而影响 Mstn 表达，促进骨骼肌生长和再生。该研究为防治衰老相关肌肉疾病提供新思路，值得科研人员一读。

　　

深圳大学医学院基础医学院、深圳市系统衰老与干预重点实验室（Shenzhen Key Laboratory for Systemic Aging and Intervention，SKL-SAI）等单位的研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了名为 “Endurance exercise remodels skeletal muscle by suppressing Ythdf1-mediated myostatin expression” 的论文。这篇论文在运动与肌肉健康、衰老相关肌肉疾病研究领域具有重要意义，为深入理解耐力运动促进骨骼肌重塑的机制提供了新视角，也为预防和治疗衰老相关的肌肉退化疾病开辟了潜在新路径。

研究背景

运动训练对人类健康益处显著，部分是通过骨骼肌重塑来实现的。在运动刺激下，骨骼肌干细胞（MuSCs，也叫卫星细胞 SCs）会被激活，同时肌源性调节因子的表达增加。近年来，越来越多的证据表明，RNA 修饰在骨骼肌内环境稳定中发挥着重要作用。N6 - 甲基腺苷（m6A）是 mRNA 中最丰富的内部修饰之一，YT521 - B 同源结构域家族（YTHDFs）和含结构域（YTHDCs）的蛋白质能识别 RNA 上的 m6A 修饰，进而调控 RNA 的稳定性、剪接、翻译和转运。比如，甲基转移酶样 3（Mettl3）介导激活素 2A 受体（Acvr2a，一种肌肉生长抑制素 Mstn 受体）的 mRNA 的 m6A 修饰，该修饰会被 Ythdf2 识别并诱导其降解；Ythdf2 还能增强泛素连接酶 Asb2 mRNA 的降解，协同抑制 TGF - β/Smad3 信号通路 。然而，RNA m6A 修饰是否介导耐力运动诱导的骨骼肌重塑，此前尚不清楚。

骨骼肌因存在特定的肌肉干细胞（MuSCs）而具有终身再生能力。SCs 通常处于静止状态，表达转录因子配对盒 7（Pax7）。当肌肉受伤时，静止的 SCs 会被激活并分化，这一过程受肌源性决定因子 1（MyoD）调控。众多生长因子和细胞因子参与调节骨骼肌的生长和再生，其中肌肉生长抑制素（Mstn，属于 TGF - β 超家族成员，也被称为生长分化因子 8，GDF8）是骨骼肌生长的负调节因子，能抑制肌细胞的增殖和分化，防止肌肉过度生长。Mstn 基因敲除的小鼠 SCs 被激活，骨骼肌再生能力提高，因此 Mstn 信号通路成为治疗肌肉萎缩的潜在靶点。在这样的背景下，开展此项研究以探究 RNA m6A 修饰在耐力运动诱导的骨骼肌重塑中的作用机制就显得尤为重要。

研究方法

1. 动物模型构建：研究人员委托赛业生物科技（苏州）有限公司，利用 CRISPR/Cas9 系统构建了 Ythdf1 基因敲除（KO）小鼠模型，背景为 C57BL/6N 小鼠。
2. 运动训练与测试：对 10 周龄雄性小鼠进行耐力运动训练，每周训练 5 天，持续 4 周。训练前，小鼠需在跑步机（15° 倾斜）上以逐渐增加的速度（10 - 17m/min）适应 3 天，每天 15min。正式训练时，小鼠需在跑步机上以 17m/min 的速度强制跑步 30min。同时，进行跑步耐力测试，测试前小鼠先在跑步机（15° 倾斜）上以 10m/min 的速度适应 2 天，每天 5min，随后以 10 - 25m/min 的速度逐渐增加进行测试，直至小鼠力竭（定义为在 0.5mA 刺激下，10s 内持续受到 > 20 次电击）。
3. 肌肉损伤与再生模型：采用心脏毒素（CTX）诱导成年小鼠胫骨前肌损伤，构建肌肉损伤与再生模型。使用异氟烷吸入麻醉系统麻醉小鼠后，向胫骨前肌注射 50μl 心脏毒素（5μg 溶液）。在损伤后的特定时间点，通过二氧化碳窒息法处死小鼠，采集胫骨前肌评估再生和修复情况。
4. 蛋白质与 RNA 相关实验：运用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测蛋白质表达水平；提取细胞或组织的总 RNA，进行 RNA 免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）、定量 PCR（qPCR）和 m6A 斑点印迹（m6A dot blot）等实验，研究 RNA 修饰和基因表达情况；通过核糖体分析（Ribosome profiling）研究 mRNA 与核糖体的结合情况；进行原代成肌细胞的分离、培养和分化实验，探究细胞水平的变化。
5. 组织学与细胞分析：对小鼠肌肉组织进行苏木精 - 伊红（H&E）染色和免疫荧光（IF）染色，观察组织学变化；运用流式细胞术（Flow cytometric analysis）分析 SCs 的数量和比例。

研究结果

1. 耐力运动抑制骨骼肌中的 m6A 和 Ythdf1：让小鼠进行 4 周中等强度的耐力运动训练后，与久坐对照组相比，训练组小鼠的骨骼肌质量、跑步距离和肌纤维面积显著增加，表明发生了骨骼肌重塑。同时，运动训练使两个关键肌源性因子 Pax7 和 MyoD 的 mRNA 水平升高，提示 SCs 被激活。有趣的是，斑点印迹显示运动训练强烈抑制了骨骼肌中 RNA 的 m6A 水平，m6A 甲基转移酶复合物 Mettl3 和 Mettl14 的表达下调，且 Ythdf1 的 mRNA 水平显著降低，而 Ythdf2/3 的 mRNA 水平无明显变化。这表明 m6A 和 Ythdf1 与运动诱导的骨骼肌重塑相关。
2. Ythdf1 缺失增强小鼠骨骼肌的有氧能力：与野生型（WT）小鼠相比，Ythdf1 基因敲除（Ythdf1 - /- ）小鼠的腓肠肌和胫骨前肌质量显著增加，跑步性能明显提高，肌纤维横截面积增大。Ythdf1 - /- 小鼠中，介导 SCs 从静止状态激活的 Pax7 和 MyoD 的 mRNA 和蛋白质水平均显著增加，SCs 数量增多。此外，Ythdf1 - /- 小鼠骨骼肌中氧化代谢相关的生物标志物（如 MHC - I、Ndufa2、Ndufb3、Ndufb5、Cox17 和 CytC）的 mRNA 水平显著上调，线粒体 DNA 水平增加，MHC - I 阳性和琥珀酸脱氢酶（SDH）阳性纤维数量增多，耗氧量增加，表明 Ythdf1 缺失诱导了骨骼肌重塑，增强了骨骼肌的有氧能力。
3. Ythdf1 抑制原代成肌细胞的增殖和分化：从 Ythdf1 - /- 小鼠和 WT 小鼠中分离原代成肌细胞进行研究。免疫荧光染色显示，Ythdf1 - /- 成肌细胞中 Ki67（SCs 增殖标记物）阳性细胞百分比更高，Pax7 和 MyoD 的 mRNA 和蛋白质水平显著上调。诱导 SCs 分化后，Ythdf1 - /- 成肌细胞向肌管的分化明显增强，融合指数分析表明 Ythdf1 缺失导致多核 MF20 肌管数量显著增加，分化相关基因 MyoG 和 eMyHC 的 mRNA 水平也显著上调。相反，Ythdf1 过表达则抑制成肌细胞增殖和分化。这表明 Ythdf1 抑制 SCs 的增殖和分化。
4. Ythdf1 增强 Mstn 翻译：与 WT 小鼠相比，Ythdf1 - /- 小鼠胫骨前肌中 Mstn 和 p - Smad3 蛋白水平显著降低。在原代成肌细胞中也得到了类似结果，且 Ythdf1 缺失不影响 Mstn mRNA 的水平和稳定性。RNA 免疫沉淀和核糖体分析表明，Ythdf1 能识别 m6A 修饰的 Mstn mRNA 并促进其翻译。对 Mstn mRNA 的 m6A 修饰位点进行突变后，Ythdf1 与 Mstn mRNA 的结合减少，Ythdf1 促进 Mstn mRNA 翻译的作用被削弱。此外，在 Ythdf1 - /- 小鼠原代成肌细胞中过表达 Mstn，会导致 Pax7、MyoD 表达水平下降，Ki67 阳性染色减少，MF20 多核肌管数量减少，MyoG 和 eMyHC 表达水平下调，表明 Ythdf1 对 SCs 的影响主要通过 Mstn 介导。
5. Ythdf1 缺失促进骨骼肌再生：利用 CTX 诱导的胫骨前肌损伤模型研究发现，Ythdf1 - /- 小鼠在肌肉损伤 3 天后，SCs 数量显著增加，MyoD 阳性细胞数量增多，SCs 增殖明显增强，MyoD、MyoG 和 eMyHC 的 mRNA 水平显著升高，Mstn 蛋白水平下调。H&E 染色和 WGA 染色显示，Ythdf1 - /- 小鼠在肌肉损伤 5 天和 9 天后，肌肉再生情况优于 WT 小鼠，表明 Ythdf1 缺失增强了急性损伤诱导的肌肉再生。
6. Ythdf1 - /- 小鼠中 SCs 数量随年龄下降：研究发现，老年 Ythdf1 - /- 小鼠的胫骨前肌重量显著低于 WT 小鼠，肌纤维变小，Pax7、MyoD、MyoG 和 eMyHC 的 mRNA 水平以及 Pax7 和 MyoD 的蛋白质水平均显著下调，Pax7 阳性细胞数量减少，表明 Ythdf1 缺失的 SCs 在衰老过程中加速耗竭。同时，老年小鼠与年轻小鼠相比，Ythdf1 和 Mstn 蛋白水平降低，Mstn mRNA 的 m6A 修饰减少，说明正常衰老过程中，骨骼肌中 Ythdf1 - Mstn 轴也会下降。

研究结论与讨论

本研究揭示了 RNA m6A 修饰在耐力运动诱导的骨骼肌重塑中的重要作用机制。Ythdf1 能识别 m6A 修饰的 Mstn mRNA 并促进其翻译，耐力运动则通过抑制 Ythdf1 的表达，下调 Mstn 水平，从而使 SCs 过度激活，促进骨骼肌生长和损伤后的再生。同时，Ythdf1 缺失会增加骨骼肌的氧化代谢，提高耐力表现。

此前研究表明，机械过载通过 Acvr2a - Smad - MyoD 信号通路诱导肌肉肥大，Mettl3 催化 m6A 修饰的 Acvr2a，经 Ythdf2 介导的 RNA 衰变促进骨骼肌肥大。本研究则发现了通过 Mstn - Acvr2a - Smad - MyoD 信号级联对骨骼肌重塑的额外调控机制。m6A 修饰在不同信号通路元件上发挥作用，YTHDFs 家族成员在调节 RNA 命运中的差异作用，共同确保了 Mstn - Acvr2a - Smad - MyoD 信号通路不会过度激活或抑制，维持骨骼肌的正常生长和发育。然而，YTHDFs 如何实现对同一信号通路中不同转录本的特异性识别和调控，仍有待进一步研究。

Ythdf1 缺失能促进体外培养的原代成肌细胞增殖和分化，在 CTX 诱导的肌肉损伤模型中，Ythdf1 基因敲除小鼠的肌肉再生能力增强，这表明 Ythdf1 对 SCs 的调节至少部分是细胞自主的。但肌肉再生还受局部和全身环境的影响，构建 MuSC 特异性 Ythdf1 基因敲除小鼠模型，有助于更深入地阐明 SCs 在 Ythdf1 缺失小鼠肌肉表型中的作用。

维持 SCs 池对预防衰老相关的肌肉衰退至关重要。在年轻的 Ythdf1 - /- 小鼠中，SCs 过度激活，但在老年小鼠中却会耗尽。这可能是因为持续抑制 Mstn 信号通路打破了 SCs 自我更新和激活的平衡，长期激活 SCs 会导致 SCs 池枯竭，损害老年小鼠的肌肉再生能力。

总的来说，本研究发现 Ythdf1 缺失对肌肉生长和身体性能有短期益处，但不利于长期的骨骼肌内环境稳定。Ythdf1 对 Mstn 信号通路的调控拓展了人们对 m6A 介导的骨骼肌重塑复杂性的理解，为进一步研究运动与肌肉健康、衰老相关肌肉疾病的治疗提供了重要的理论基础和潜在的干预靶点。