《Scientific Reports》肥胖症患者肝肾组织qPCR内参基因的评价

　　

波兰波兹南医科大学（Poznan University of Medical Sciences）临床化学与分子诊断学系的 Aleksandra Romaniuk-Drapa?a 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Evaluation of reference genes for qPCR in human liver and kidney tissue from individuals with obesity” 的论文。该论文在肥胖相关疾病研究领域意义重大，为后续准确研究肥胖人群肝脏和肾脏组织中的基因表达变化提供了关键的参考依据。

研究背景

肥胖问题日益严峻，在全球范围内呈现快速增长的趋势。美国肥胖率从 1991 年的约 12% 急剧上升到 30 年后的约 42%，世界肥胖地图集更是预测，到 2035 年全球将有超过 40 亿人（占全球人口的 51% 以上）BMI（身体质量指数， ， ）≥25，被视为超重或肥胖。肥胖是一种慢性、多因素且复杂的疾病，主要由体内脂肪过度积累导致，环境因素如过量饮食和久坐不动的生活方式在其发展过程中起着重要作用，当然遗传因素也不可忽视。

肥胖会显著增加许多并发症的风险，如糖尿病、高血压和胰岛素抵抗等，这些并发症会直接或间接影响肝脏和肾脏的正常功能。在 BMI 过高的情况下，影响肝脏和肾脏的常见疾病包括非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和慢性肾脏病（CKD）。肥胖会干扰肝脏和肾脏的多种代谢功能，随着肥胖时间的延长，大量游离脂肪酸（FFAs）涌入肝脏，超出了生理适应机制的处理能力，引发内质网（ER）应激、活性氧（ROS）生成，进而导致肝细胞功能障碍和损伤，还会通过异常脂肪沉积和炎症影响肝脏和肾脏中不同途径和过程的基因表达。此外，越来越多的证据表明，NAFLD 的发生和严重程度与 CKD 的发病率增加密切相关。而且，肥胖还可能影响药物的药代动力学，因此深入了解肥胖相关的分子机制，优化治疗干预措施，提高药物安全性和疗效迫在眉睫。

在研究肥胖相关的分子机制时，定量聚合酶链式反应（qPCR）是检测基因表达变化的 “金标准”，它具有高特异性、高灵敏度和良好的重复性。然而，要获得准确的 qPCR 结果，需要完成多个技术步骤并进行一系列质量控制。由于起始材料的量、逆转录酶的酶促效率以及反应抑制剂的存在等因素，会导致定量误差。这时就需要参考基因（RGs，也称为管家基因 HKG）对表达数据进行标准化处理，以减少 RNA 数量和质量差异带来的非特异性变异，从而更准确地比较不同样本间的基因表达水平。合适的参考基因在不同个体、组织类型、疾病状态和实验条件下应保持稳定表达，但目前一些常用的参考基因在不同组织和病理生理条件下的稳定性并未得到充分验证，这严重影响了 qPCR 数据的可靠性。

研究方法

为了筛选出适用于肥胖人群肝脏和肾脏组织基因表达分析的稳定参考基因，研究人员开展了一系列实验。

研究人员从美国国家疾病研究交流中心（National Disease Research Interchange，NDRI）获取了 42 例肝脏和肾脏的尸检标本。所有研究均遵循《赫尔辛基宣言》和《良好临床实践指南》的伦理原则，由于标本来自 NDRI 组织库且无法识别身份，经罗格斯生物医学与健康科学中心（Rutgers Biomedical and Health Sciences）批准，无需获取受试者同意。NDRI 要求其网络中的所有组织来源站点必须获得组织捐赠者（或其近亲）的书面知情同意，才可将组织用于研究，并且会拒收任何有疾病迹象（如恶性肿瘤、肝硬化）的组织。研究人员收集标本后立即速冻，用干冰运输，并储存在 - 80°C 冰箱中直至分析。同时，研究人员详细记录了捐赠者的年龄、种族、性别、体重、BMI、病史、伴随疾病、用药清单、手术史、死亡日期和时间、死亡原因、尸检日期和时间（包括死后间隔时间 PMI）等信息，并根据 BMI 将捐赠者分为健康体重（BMI 为 18.5 - 25 ）和超重（BMI≥25 ）两组。

研究人员使用 AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit 和 RNeasy Mini Kit（均来自 Qiagen 公司），按照制造商的方案从肝脏和肾脏样本中提取总 RNA 并进行纯化。用 TissueLyser 将组织（每个样本约 30 - 35mg）在专用缓冲液中匀浆，然后使用 NanoDrop 2000 测定 RNA 的数量和质量，确保所有样本的 260/280 比值均超过 1.8，排除蛋白质污染。接着，使用商业 RT2 First Strand Kit（Qiagen 公司）按照推荐方案合成 cDNA（0.5μg），并将 cDNA 样本储存在 - 20°C 备用。

研究人员利用 96 孔板 RT2 Profiler PCR Array Systems（基于 SYBR - Green 的方法，Qiagen 公司）和 QuantStudio 7 Pro 实时 PCR 仪器（Thermo Scientific 公司）对 5 个管家基因进行实时定量 PCR 分析。另外两个管家基因（18S rRNA 和 PPIA）的引物则从 Qiagen 公司购买。qPCR 反应先在 95°C 激活 Hot Start DNA Taq 聚合酶 10 分钟，然后进行 40 个扩增循环，热循环条件为 95°C 变性 15 秒，60°C 退火和延伸 1 分钟并采集荧光数据。反应结束后生成熔解曲线，以区分特异性和非特异性扩增产物（所有情况下，升温速率均为 1°C/s），所有分析的截止值均设为 35 个循环。

研究人员基于三个重复实验的未转换平均值，使用比较法、geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 程序分析了所有候选参考基因（ACTB、B2M、RPLP0、HPRT1、GAPDH、18S rRNA 和 PPIA）在肝脏和肾脏样本中的基因表达稳定性。最后，通过在线工具 RefFinder 计算这些分析结果的几何平均值，从而得到参考基因候选物的综合排名。

研究结果

研究人员首先对 42 名研究对象的人体测量和临床特征进行了统计（见表 1），肾脏和肝脏样本分别来自 28 - 32 名已故捐赠者（18 名捐赠者同时提供了两种组织）。表 2 展示了所有测试参考基因候选物的原始值的描述性统计数据。

Variables	Kidney samples 1=28	Liver samples 1=32
Age (yr)	60.0±2.7	62.4±2.4
Sex
Female (%)	7(25.0)	13(40.6)
Male (%)	21(75.0)	19(59.4)
BMI (kg/m2)	28.3+2.0	28.2±2.0
Normal weight (%)	13(46.4)	15(46.9)
Overweight (%)	6(21.4)	8(25.0)
Obese (%)	9(32.1)	9(28.1)
Body weight (kg)	83.6+6.2	81.4±6.2
Post-mortem interval (h)	13.4±1.0	13.4±0.8
Race
African American (%)	4(14.3)	3(9.4)
Caucasian (%)	23 (82.1)	28 (87.5)
Unknown(%)	1(3.6)	1(3.1)
Concomitant diseases
Asthma (%)	7(25.0)	8(25.0)
COPD (%)	8(28.6)	7(21.9)
Diabetes type 1(%)	0(0.0)	1(3.1)
Diabetes type 2(%)	3(10.7)	5(15.6)
Hypertension (%)	24(85.7)	25(78.1)
Heart failure(%)	0(0.0)	4(12.5)
Thyroid disorder (%)	1(3.6)	3(9.4)
Depression (%)	4(14.3)	4(12.5)
Anxiety (%)	2(7.1)	2(6.3)
Joint pain (%)	4(14.3)	7(21.9)
CAD(%)	5(17.9)	4(12.5)

表 1. 研究人群的临床特征。CAD - 冠状动脉疾病；COPD - 慢性阻塞性肺疾病。连续数据以平均值 ± 标准误表示。分类数据以百分比表示。

	Kidney tissue (n=28)			Liver tissue (n=32)
	Mean ±SEM	Median(Q1;Q3)	Min -max	Mean±SEM	Median(Q1;Q3)	Min - max
ACTB	25.85±0.43	25.71 (24.03; 26.76)	20.60-30.95	25.42±0.31	25.32 (24.63; 26.49)	22.11-30.35
B2M	26.05±0.42	25.93(24.49; 27.29)	20.76-30.65	25.53±0.34	25.61 (24.19, 26.67)	22.35-30.54
GAPDH	26.34±0.41	26.18 (25.34; 27.36)	21.97-30.72	25.94±0.25	25.89 (25.30, 26.67)	23.06-29.99
HPRTI	30.29±0.32	29.93(29.19; 31.26)	26.52-33.45	31.13±0.26	30.91(30.26; 31.90)	28.35-34.51
RPLPO	25.63±0.40	25.61 (24.30; 26.66)	20.42-29.61	24.82±0.24	24.68 (23.90, 25.64)	22.46-27.85
18S RNA	9.40±0.09	9.40 (9.06;9.71)	8.57-10.52	8.50±0.07	8.47 (8.24; 8.70)	7.66-9.44
PPIA	30.85±0.39	30.83 (28.96; 32.59)	27.06-34.21	29.56±0.33	29.45 (28.52; 30.25)	25.81-34.24

表 2. 肾脏和肝脏所有测试参考基因候选物的原始值的描述性统计。

geNorm 分析基于基因稳定性度量 M（M 值升高表明成对变异增加），结果显示在肾脏组织中，RPLP0 和 GAPDH 是最佳参考基因，而 18S rRNA 稳定性最差；在肝脏组织中，ACTB 和 GAPDH 排名靠前，18S rRNA 同样是表达最不稳定的基因（见图 1）。

NormFinder 分析通过估计候选基因之间的组内和组间表达变异来确定稳定表达的基因，稳定性值越低，基因表达越稳定。该分析表明，在肾脏中最稳定的参考基因是 HPRT1，其次是 RPLP0；在肝脏中则是 GAPDH，其次是 RPLP0（见图 2）。

BestKeeper 是一款基于 Excel 的软件，它通过计算每个参考基因候选物的描述性统计数据，利用标准偏差（SD）和变异系数（CV）对基因稳定性进行评估。结果显示，在肾脏和肝脏组织中，18S rRNA 被选为最稳定的基因。

ΔCt 方法通过计算每对参考基因候选物的值来判断基因的稳定性，值波动越小（SD 值越低），基因越稳定。研究发现，在肾脏组织中，RPLP0 和 HPRT1 最稳定，在肝脏组织中，GAPDH 和 RPLP0 表现最佳（见图 3）。

考虑到上述四种方法的结果各有差异，难以直接判断最佳参考基因。研究人员使用 RefFinder 工具进行综合排名，在肾脏组织中，参考基因稳定性排名为：RPLP0（最稳定，排名值 =1.565）、HPRT1（2.000）、GAPDH（2.449）、ACTB（4.120）、18S rRNA（4.304）、B2M（5.439）和 PPIA（最不稳定，排名值 =5.733）；在肝脏组织中，GAPDH（排名值 = 1.189）最稳定，其次是 ACTB 和 RPLP0（排名值均为 2.783）、HPRT1（3.722）、18S rRNA（4.304）、B2M（4.787）和 PPIA（6.000）（见图 4）。

Rank	geNorm	NormFinder	BestKeeper	AC	RefFinder comprehensive ranking
Kidney tissue
1	GAPDH& RPLPO	HPRTI	18S RNA	RPLPO	RPLPO
2		RPLPO	HPRTI	HPRTI	HPRTI
3	ACTB	GAPDH	RPLPO	GAPDH	GAPDH
4	HPRTI	ACTB	GAPDH	ACTB	ACTB
5	B2M	B2M	PPIA	B2M	18S RNA
6	PPIA	PPIA	ACTB	PPIA	B2M
7	18S RNA	18S RNA	B2M	18S RNA	PPIA
Liver tissue
1	GAPDH & ACTB	GAPDH	18S RNA	GAPDH	GAPDH
2		RPLPO	GAPDH	RPLPO	ACTB & RPLPO
3	B2M	HPRTI	RPLPO	ACTB
4	HPRTI	ACTB	HPRTI	HPRTI	HPRTI
5	RPLPO	B2M	ACTB	B2M	18S RNA
6	PPIA	PPIA	PPIA	PPIA	B2M
7	18S RNA	18S RNA	B2M	18S RNA	PPIA

表 4. 使用 geNorm、NormFinder、BestKeeper 和 ΔC方法获得的归一化控制基因候选物的排名顺序（排名 1 - 最稳定的基因；排名 7 - 最不稳定的基因）。加粗的基因被选为参考基因（肾脏中为 RPLP0 和 HPRT1，肝脏中为 RPLP0 和 GAPDH）。

研究结论与讨论

本研究通过对肥胖人群肝脏和肾脏组织中常用参考基因的表达稳定性进行系统分析，确定了适用于肥胖研究中 qPCR 分析的可靠参考基因组合。在肾脏组织中，RPLP0 和 HPRT1 是理想的参考基因；在肝脏组织中，RPLP0 和 GAPDH 表现最佳。这一研究成果填补了肥胖人群肝脏和肾脏组织参考基因选择方面的空白，为后续相关研究提供了重要的参考依据。

研究人员指出，qPCR 相对基因表达的可重复性高度依赖参考基因的稳定性，若选择不当，会导致基因表达谱出现偏差，精度降低