介绍AVAC作为一个超灵敏的平台，具有广泛的动态范围，用于高通量多路生物标志物检测，使用等离子体纳米粒子的数字计数

　　

西班牙 Mecwins S.A. 公司的研究人员 Virginia Cebrián、Valerio Pini、Andreas Thon 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Introducing AVAC as an ultrasensitive platform with broad dynamical range for high-throughput multiplexed biomarker detection using digital counting of plasmonic nanoparticles” 的论文。这篇论文在生物医学检测领域意义重大，为疾病的早期诊断和有效治疗提供了新的技术手段。

研究背景

在生物医学领域，准确检测和量化超痕量的生物标志物对疾病诊断和治疗极为关键。像艾滋病这类传染病、炎症性疾病以及心血管疾病，在疾病早期，生物标志物在体液（如血液、唾液或尿液）中的浓度极低，同时还存在于复杂的生物环境中，这给检测带来了巨大挑战。例如，在急性 HIV 感染时，虽然血液中会出现 p24 蛋白，但因其浓度低，检测难度很大。

目前，临床常用的检测技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、化学发光免疫分析（CLIA）和聚合酶链反应（PCR）等，都存在一定的局限性。ELISA 虽广泛用于蛋白质检测，但检测低丰度生物标志物时灵敏度不足，且多重检测能力有限；CLIA 虽通过化学发光标签增强信号提高了灵敏度，但需要专业设备，成本高，多重检测在技术上也面临挑战；PCR 对核酸检测灵敏度高，却不适用于蛋白质生物标志物检测，且操作复杂，难以用于常规诊断。因此，开发一种集超灵敏检测、高特异性、宽动态范围和强大多重检测能力于一体的创新诊断平台迫在眉睫。

关键技术方法

研究人员开发的 AVAC 平台是一种基于反射暗场显微镜和等离子体金纳米颗粒数字计数的全自动光学平台。该平台使用的标准纳米颗粒是直径 100nm 的球形金纳米颗粒（GNPs），不过也能适应其他材料、尺寸、形状和结构的颗粒。它采用的基底是玻璃、硅或聚合物等具有高平整度和超低粗糙度的介电材料，这些基底有助于纳米颗粒产生等离子体响应，并且能与暗场显微镜兼容。

AVAC 平台的检测流程与 ELISA 三明治结构类似。首先，通过一系列化学步骤在基底上固定高密度的定向捕获抗体，并用封闭剂减少非特异性结合。检测时，将带有样品的可拆卸 96 孔结构安装在基底上，样品与包被有检测抗体的功能化纳米颗粒孵育，孵育后洗涤、移除孔结构、干燥基底，再将其放入 AVAC 扫描仪进行分析。扫描仪利用电动 XY 平台扫描样品，通过高速、低噪声的 CMOS 相机在每个孔中捕获多个高分辨率暗场图像，照明由高功率暖白色 LED 提供，主动自动聚焦确保精确聚焦。

图像会由专有分析软件同步处理。软件算法主要包含识别、表征、分类和计数四个步骤：识别所有潜在颗粒；分析颗粒的散射强度和光谱等参数；根据表征结果对颗粒进行分类；对每类颗粒进行数字计数。最后，利用校准曲线将平均颗粒计数转换为生物标志物浓度。

研究结果

1. AVAC 平台技术
   • 平台概述：AVAC 平台可对用作生物标志物标签的等离子体纳米颗粒进行快速检测和数字计数。其灵活的光学系统允许定制关键组件，已在全球多个主要司法管辖区获得专利。该平台能扫描最大尺寸为 80mm×120mm 的任意形状基底，为方便与现有实验室设备兼容，采用了标准尺寸。在检测过程中，通过一系列操作，能实现对样品的高效检测，每小时可扫描和分析多达 20,000 张图像，处理 96 孔检测只需 5 - 15 分钟，适用于高通量检测场景。
   • 数字单颗粒计数：AVAC 平台的核心功能是能够识别、分类和计数单个纳米颗粒。利用等离子体纳米颗粒和高分辨率光学系统在反射暗场模式下协同工作，该平台能在潜在污染物中准确识别纳米颗粒。通过结合亮度和颜色等特征进行分类，不仅能区分纳米颗粒和污染物，还能分辨纳米颗粒的单体、二聚体、三聚体及更高阶聚集体，提高了生物标志物定量的准确性。研究人员通过与扫描电子显微镜（SEM）图像对比，验证了 AVAC 平台颗粒识别和分类的准确性。
   • 多重检测能力：AVAC 平台基于不同颗粒的光学特性差异，可实现多重检测，能在同一样品中同时测量多种生物标志物。研究人员通过使用不同直径的球形 GNPs（如 80nm、100nm 和 150nm）进行实验，结果显示，该平台能清晰区分不同直径的 GNPs，实现对多种生物标志物的同时检测。
   • 平台的动态范围：在检测不同浓度的纳米颗粒时，AVAC 平台的数字计数方法在低浓度区域表现出色，不受背景信号变化的影响，而模拟积分方法在高浓度区域能更准确地估计纳米颗粒数量。AVAC 平台的计数范围可覆盖超过四个数量级，从每孔约 100 个纳米颗粒到个纳米颗粒，满足了不同生理状态和疾病条件下生物标志物浓度差异较大的检测需求。
   
   
2. 生物应用展示 AVAC 平台的能力
   • 超灵敏检测 HIV p24 蛋白：研究人员开发了一种使用 AVAC 的高灵敏度 p24 免疫测定法，用于检测人血清样本中的 p24 蛋白。该方法的检测限（LoD）低至 26fg/mL，特异性达到 98.2%，批内变异系数（CV）为 7.5%，批间变异系数为 4.2%。与商业检测方法相比，AVAC p24 检测能够更早地识别 HIV 感染，展现出其在早期疾病检测方面的优势。
   • 精确量化白细胞介素 - 6（IL - 6）：IL - 6 是一种关键的促炎细胞因子，准确量化 IL - 6 对患者管理和疾病监测至关重要。研究人员开发的 AVAC 免疫测定法在检测 IL - 6 时，检测限（LoD）为 0.12pg/mL，定量下限（LLoQ）为 0.16pg/mL，定量上限（ULoQ）为 850pg/mL，稀释线性度为 107.7%，批内 CV 为 7.2%，批间 CV 为 6.1%。与 Quanterix Simoa IL - 6 Advantage 试剂盒相比，AVAC IL - 6 检测具有良好的相关性（），表明其分析性能与领先的超灵敏免疫测定标准相当。
   • 多重检测 IL - 6、心肌肌钙蛋白 I（cTnI）和 B 型利钠肽（BNP）：研究人员利用 AVAC 平台的多重检测能力，同时检测了 IL - 6、cTnI 和 BNP 这三种与心血管疾病相关的生物标志物。在三重检测配置中，AVAC 平台保持了与单重检测相当的低定量限，回收率在可接受范围内，证明了该平台在多重检测时的准确性和可靠性，为心血管疾病的诊断提供了更全面的信息。
   
   

研究结论与意义

AVAC 平台利用等离子体金纳米颗粒作为光学标签和反射暗场显微镜技术，实现了超灵敏、高通量和多重生物标志物检测。与传统检测技术相比，它在检测灵敏度、动态范围和多重检测能力等方面具有显著优势。例如，在检测 HIV p24 抗原时，检测限达到超痕量水平，有助于艾滋病的早期诊断；在检测 IL - 6 时，能够在宽浓度范围内精确量化，为炎症性疾病和癌症等的监测提供了有力工具；在多重检测方面，同时检测多种心血管疾病相关生物标志物的能力，为心血管疾病的诊断和病情评估提供了更全面的依据。

尽管将 AVAC 平台整合到现有临床工作流程中还需要优化成本效益并获得监管批准，但它与当前实验室基础设施的兼容性和高通量操作的特点，使其在临床应用中具有广阔的前景。未来，如果能将 AVAC 扫描仪与样品处理模块集成，将进一步简化整体工作流程。AVAC 平台为生物标志物检测带来了新的突破，有望推动早期诊断、疾病监测和个性化医学的发展，通过提高诊断准确性和全面的生物标志物分析，为更有效的医疗保健提供支持。