miRNA测序鉴定了免疫相关的miRNA

　　

徐州医科大学附属徐州妇幼保健院医疗重症监护室（Department of Medical Intensive Care Unit, Xuzhou Maternity and Child Health Care Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University）等单位的研究人员 Can Li、Xinxing Sun、Xiaojuan Yang 等，在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “miRNA sequencing identifies immune-associated miRNAs and highlights the role of miR-193b5p in sepsis and septic shock progression” 的论文。这篇论文在脓毒症（sepsis，一种由宿主对感染的失调反应导致的危及生命的器官功能障碍）和感染性休克（septic shock，脓毒症的一种严重亚型，具有显著的循环、细胞和代谢异常，死亡率极高）研究领域意义重大，为深入了解这两种疾病的发病机制以及寻找新的诊断标志物提供了重要依据。

研究背景

脓毒症和感染性休克是极其凶险的疾病。据统计，全球每年约有 4890 万脓毒症患者，其中 1100 万人死亡，占全球总死亡人数的 19.7%。这不仅给患者家庭带来沉重负担，也让各国的医疗资源面临巨大消耗。虽然 2021 年国际脓毒症和感染性休克管理指南强调早期识别和及时治疗能降低发病率和死亡率，但目前常用的血培养、C 反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、白细胞介素 - 6（IL - 6）和白细胞（WBC）计数等检测手段，在诊断脓毒症时速度和准确性都不尽如人意。

脓毒症的病理生理过程极为复杂，涉及促炎反应、免疫抑制和内皮功能障碍等多个方面。其中，免疫炎症反应在疾病发展中起着关键作用。疾病早期，免疫细胞和炎症介质会引发过度的炎症反应；而到了后期，则会出现严重且持久的免疫抑制。这种免疫介导的损伤受体内复杂分子网络调控，最终导致器官功能障碍。

近年来，微小核糖核酸（miRNAs，一类内源性非编码 RNA 分子，长度约 21 个核苷酸，虽不编码蛋白质，但能通过与靶基因结合调控其表达）成为极具潜力的生物标志物。已有研究表明，部分 miRNAs 与脓毒症的发展相关，但脓毒症是一种异质性、动态变化的综合征，单一或少数几个指标难以全面反映其免疫和炎症反应的失调情况。因此，深入研究免疫反应在脓毒症发展中的作用，筛选关键调控点并进行干预，对提高脓毒症的临床治疗效果至关重要。

研究方法

1. 研究对象选取：研究人员从宁夏医科大学总医院重症监护室（ICU）选取了 6 例脓毒症患者、6 例感染性休克患者和 3 例健康志愿者，采集他们的血清样本进行 miRNA 测序。之后，又开展了一项前瞻性观察研究，纳入了脓毒症患者、感染性休克患者和普通外科手术患者（作为对照组），在患者入住 ICU 24 小时内采集血液样本，用于后续关键 miRNA 的验证。所有参与者均为成年人（≥18 岁），排除有肿瘤病史、接受免疫抑制治疗、放疗或长期使用化疗药物的患者。

2. 实验技术手段
   

• 外泌体提取：采集 20mL 静脉血样本，先在室温放置 30 分钟，再置于 4°C 环境 3 - 4 小时，然后经过两次离心，将所得血清转移至无 RNA 酶的冻干管中，保存于 - 80°C。采用超速离心法在 37°C 提取外泌体。

• 差异表达 miRNA（DEMs）筛选：利用高灵敏度的 Agilent 2100 pic600 测量 RNA 的总量和片段分布，构建 cDNA 文库，通过 Illumina SE50 技术进行测序。对原始测序数据进行质量控制、长度筛选和参考序列比对，使用 R 软件中的 DESeq2 包，以 P<0.05 和 | log2 倍变化 |>1 为标准，筛选出 DEMs。

• 靶基因预测：通过 TargetScan Human 8.0、miRWalk 3.0 和 miRDB 6.0 这三个公共数据库预测 miRNA 与 mRNA 的相互作用对。从比较毒理基因组学数据库（CTD）获取脓毒症和感染性休克相关基因，并排除其他感染性疾病相关基因，最终通过四个数据库结果的交集确定靶基因。

• 通路富集分析：运用 Metascape 数据库和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行 KEGG 富集分析，以探索基因的生物学功能。筛选标准为 P 值 < 0.05 和 Q 值 < 0.05，利用 ChiPlot 对 KEGG 富集结果进行可视化。

• 蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络构建与枢纽基因提取：选择与免疫功能相关的通路，使用 STRING 数据库对富集在这些通路中的基因进行 PPI 网络分析，设定置信度得分阈值为 0.40，P<0.05。利用 Cytoscape 软件对 PPI 网络进行可视化，通过 CytoHubba 插件中的最大团中心性（MCC）算法确定枢纽基因。

• DEMs - 信使 RNA（mRNAs）网络构建：基于筛选出的 DEMs 及其在免疫相关通路中富集的靶基因构建网络，借助 Cytoscape 软件可视化，从而确定关键的 DEMs。

• 关键 miRNA 的验证：选取 90 名参与者（30 例感染性休克患者、30 例脓毒症患者和 30 例普通外科手术患者）进行前瞻性研究。采集 1mL 静脉血样本，加入 RNA SolidTM 试剂后保存于 - 30°C，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT - PCR），使用 2×SYBR Green qPCR Master Mix（无 ROX）对 miR - 193b - 5p 和 miR - 511 - 5p 的表达水平进行定量分析，通过方法计算相对表达量。

3. 数据分析方法：使用 SPSS 26.0 软件进行数据分析，用 EpiData 3.0 软件记录参与者的住院数据。正态分布的连续变量以均值 ± 标准差（SD）表示，采用 Student's t 检验；偏态分布的连续变量以中位数（四分位数间距，IQR）表示，运用 Mann - Whitney U 检验。分类变量以频率和百分比表示，使用卡方检验进行比较。通过单因素方差分析（ANOVA）或 Kruskal - Wallis H 检验评估多组间的差异。运用 MedCalc 19.7.2 软件进行受试者工作特征（ROC）曲线分析，以评估 miR - 193b - 5p 和 miR - 511 - 5p 对脓毒症和感染性休克的诊断准确性。利用 Spearman 相关性分析探究 miR - 193b - 5p、miR - 511 - 5p 与炎症或免疫相关指标之间的关系。设定显著性水平 α = 0.05，P<0.05 为具有统计学意义。

研究结果

1. 外泌体 miRNA 谱分析：研究人员对脓毒症患者、感染性休克患者和健康对照者的血清外泌体进行 miRNA 谱分析，发现脓毒症与感染性休克患者之间有 19 个 miRNA 差异表达，脓毒症患者与健康对照者之间有 124 个，感染性休克患者与健康对照者之间有 212 个。通过热图和火山图直观展示了这些差异表达的 miRNA。

2. 靶基因预测：预测了每组比较中排名前 10 的上调和下调 DEMs 的靶基因。脓毒症与感染性休克之间预测出 356 个上调和 614 个下调的靶基因；脓毒症患者与健康对照者之间有 670 个上调和 327 个下调的靶基因；感染性休克患者与健康对照者之间有 378 个上调和 204 个下调的靶基因。通过维恩图清晰呈现了这些靶基因的分布情况。

3. 脓毒症和感染性休克相关基因的通路富集分析：KEGG 通路富集分析表明，靶基因与免疫调节密切相关。脓毒症患者与感染性休克患者相比，下调的靶基因在白细胞跨内皮迁移（hsa04670）和 T 细胞受体（TCR）信号通路（hsa04660）中显著富集。脓毒症患者与健康对照者相比，上调的靶基因在 FcεRI 信号通路（hsa04664）、FcγR 介导的吞噬作用（hsa04666）和 TCR 信号通路（hsa04660）中富集。感染性休克患者与健康对照者相比，上调的靶基因主要涉及辅助性 T 细胞 17（Th17）细胞分化（hsa04659）、TCR 信号通路（hsa04660）等多个免疫相关通路。通过气泡图直观展示了这些通路的富集情况。

4. PPI 网络和枢纽基因提取：构建 PPI 网络并提取枢纽基因。脓毒症与感染性休克之间下调靶基因的 PPI 网络包含 5 个枢纽基因（MAPK3、PIK3CA、MAP2K7、CD8A 和 CXCL12）；脓毒症患者与健康对照者之间上调靶基因的 PPI 网络有 PIK3CA、KRAS 等枢纽基因；感染性休克患者与健康对照者之间上调靶基因的 PPI 网络中，KRAS、MAPK14 等是关键枢纽基因。

5. DEMs - mRNAs 网络构建：构建 DEMs - mRNAs 网络后发现，miR - 511 - 5p 和 miR - 193b - 5p 与网络中的多个基因相关，在脓毒症组中的表达低于感染性休克组。miR - 4433b - 3p 和 miR - 3158 - 5p 在脓毒症组与健康对照组的比较中表现为关键 miRNA，且在脓毒症组中上调。在感染性休克组中，miR - 3158 - 5p 等多个 miRNA 发挥着重要作用。

6. 脓毒症和感染性休克患者中 miR - 193b - 5p 和 miR - 511 - 5p 的表达水平分析：对 90 名参与者进行 qRT - PCR 验证，结果显示脓毒症患者和感染性休克患者的 miR - 193b - 5p 表达水平显著低于健康对照者，但脓毒症患者和感染性休克患者之间该 miRNA 表达水平无显著差异。miR - 511 - 5p 在三组间的表达水平均无显著差异。

7. miR - 193b - 5p 和 miR - 511 - 5p 在脓毒症诊断和区分病情严重程度方面的潜力：将脓毒症和感染性休克组合并为疾病组与对照组比较，二元逻辑回归分析表明，调整年龄和性别因素后，miR - 193b - 5p 可作为脓毒症和感染性休克的保护因素。ROC 曲线分析显示，miR - 193b - 5p 诊断脓毒症的曲线下面积（AUC）为 0.797，具有较好的预测能力；miR - 511 - 5p 的 AUC 为 0.530，预测性能较差；两者联合的 AUC 为 0.795。miR - 193b - 5p 预测脓毒症的最佳截断值为 2.08，敏感性为 85.0%，特异性为 73.3%。在区分感染性休克和脓毒症方面，miR - 193b - 5p、miR - 511 - 5p 及其联合的 AUC 值分别为 0.587、0.520 和 0.590，预测性能无显著差异。根据 miR - 193b - 5p 水平将参与者分组后发现，miR - 193b - 5p≤2.08 的患者，序贯器官衰竭评估（SOFA）评分更高，炎症指标（如 hs - CRP、PCT、IL - 6）水平更高，淋巴细胞计数更低，病情更严重。

8. miR - 193b - 5p、miR - 511 - 5p 与免疫和炎症指标的相关性：Spearman 相关性分析显示，miR - 193b - 5p 与 CRP、PCT、IL - 6 呈负相关，与淋巴细胞计数呈正相关，且这些相关性具有统计学意义。而 miR - 511 - 5p 与各项免疫和炎症指标的相关性均不显著。

研究结论与讨论

本研究通过小 RNA 测序技术，在脓毒症患者、感染性休克患者和健康对照者中筛选出差异表达的 miRNA，并构建相关网络，确定了 miR - 193b - 5p 和 miR - 511 - 5p 这两个与免疫功能相关的潜在生物标志物。后续的 qRT - PCR 验证表明，miR - 193b - 5p 在脓毒症和感染性休克患者中的表达水平显著降低，且与炎症反应和免疫调节密切相关，具有作为脓毒症诊断和病情评估生物标志物的潜力。

KEGG 通路分析发现，脓毒症和感染性休克患者的靶基因在多个免疫通路中显著富集，这进一步证实了免疫反应失调在疾病发生发展中的关键作用。在构建的 DEMs - mRNAs 网络中，筛选出的关键 miRNA 与免疫相关靶基因相互作用，提示它们在脓毒症免疫调节中的重要性。其中，miR - 193b - 5p 的临床意义尤为突出，其表达水平不仅与脓毒症患者的病情严重程度相关，还能有效区分脓毒症患者和健康对照者。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，miRNA 测序和 qRT - PCR 验证的样本量较小，可能影响研究结果的普遍性，未来需要在细胞和动物水平进行验证，并扩大样本量。其次，研究仅检测了患者纳入时 miR - 193b - 5p 和 miR - 511 - 5p 的表达水平，未对疾病进展过程中的表达变化进行动态监测。尽管如此，该研究仍为脓毒症的研究开辟了新方向。它从免疫功能调节的角度出发，利用先进的生物信息学技术和实验方法，深入探究了脓毒症和感染性休克的发病机制，为脓毒症的准确诊断和靶向治疗提供了重要的理论依据，有望推动脓毒症临床诊疗水平的进一步提升。