玉米叶鞘斑病菌高粱表occum的近全基因组和侵染转录组

　　

中国农业大学植物保护学院（Department of Plant Pathology, College of Plant Protection, China Agricultural University）的研究人员 Vijai Bhadauria 等人在《Scientific Data》期刊上发表了题为 “Near-complete genome and infection transcriptomes of the maize leaf and sheath spot pathogen Epicoccum sorghinum” 的论文。这篇论文对于深入探究玉米叶鞘斑病病原菌的致病机制，以及保障玉米安全生产等领域有着极为重要的意义。

研究背景

玉米（Zea mays L.）作为全球最重要的主食作物之一，在粮食供应、动物饲料、生物燃料及可降解塑料生产等方面发挥着关键作用 。然而，真菌病害严重威胁着玉米的产量。据统计，在北美和亚洲，真菌病害分别造成玉米约 10.6% 和 12% 的产量损失。

Epicoccum sorghinum Sacc.（又称 Phoma sorghina）引起的玉米叶鞘斑病是中国玉米种植中出现的一种新病害。中国作为世界第二大玉米生产国，这一病害的出现带来了严峻挑战。E. sorghinum 属于高粱粒霉复合菌群中的一种子囊菌真菌，它不仅会降低作物产量，减少种子活力和粒重，还能产生一种名为细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid）的霉菌毒素，使高粱谷物无法作为食物或饲料使用。此外，该病原菌寄主范围广泛，近年来在中国已被报道可引起水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）和菜心（Brassica rapa ssp. parachinensis）等多种经济作物的叶斑病。为了揭示 E. sorghinum 侵染玉米的分子机制，研究人员对其菌株 NJC07 进行了基因组和感染转录组测序研究。

研究方法

1. 真菌和植物材料准备：E. sorghinum 菌株 NJC07 于 2020 年从中国江苏省南通市玉米田受感染的玉米叶鞘中分离获得，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上常规培养。玉米自交系 B73 对叶鞘斑病敏感，在生长室中培养。
2. 基因组测序：从培养的真菌菌丝体中提取基因组 DNA（gDNA），分别使用 Illumina NovaSeq 6000 和 Oxford Nanopore GridION 平台进行测序。Illumina 测序时，对 gDNA 进行片段化、末端修复、加 A 尾、连接接头等操作构建配对末端文库；Oxford Nanopore 测序则需对 gDNA 进行片段化、选择大片段、末端修复、加 A 尾、连接测序接头等步骤构建文库。
3. 基因组大小估计和组装：利用 Illumina 配对末端 reads，通过去除接头、校正测序错误、修剪低质量 reads、计数 k -mers 等操作估计基因组大小。使用 Falcon 和 Canu 对 Oxford Nanopore 长 reads 进行从头组装，再用 Pilon 软件利用 Illumina 配对末端 reads 校正组装结果。
4. 重复元件预测：运用多种软件基于结构同源性和从头预测的方法，对 E. sorghinum NJC07 基因组中的转座 DNA 元件进行分类和预测，并使用 RepeatMasker 软件结合真菌特异性重复 DNA 元件库 RepBase 对基因组进行重复元件屏蔽。
5. 基因组注释：通过从头预测、基于证据（RNA - Seq）预测和基于同源性（E. nigrum）预测三种方法对屏蔽重复元件后的基因组进行蛋白质编码基因注释，再用 EVidenceModeler 整合预测结果。同时，使用 tRNAscan - SE 和 Infernal 预测非编码 RNA，通过与 Rfam 数据库比对预测其他非编码基因模型。
6. RNA - Seq：选取 V3 期 B73 植株的第三片叶子，用 NJC07 菌株的菌丝块接种，设置三个生物学重复。在接种后 48 小时和 96 小时收集感染组织及 NJC07 菌丝体，提取 RNA 并进行一系列处理构建 cDNA 文库，在 NovaSeq X Plus 平台测序。对测序得到的原始 reads 进行处理、比对、组装和转录本丰度估计，从而确定基因表达情况。

研究结果

1. 基因组组装：研究人员通过 Oxford Nanopore GridION 和 Illumina NovaSeq 6000 平台对 E. sorghinum 菌株 NJC07 进行测序，最终获得了近乎完整、无间隙的核基因组组装。该核基因组大小为 32.69 Mb，由 22 个 contigs 组成（其中包括 12 条全长染色体）， contig 长度为 1,661,624bp ，同时还获得了完整的线粒体基因组组装，大小为 61.24 kb。这一成果为后续深入研究该病原菌的遗传信息奠定了坚实基础。
2. 基因组特征：NJC07 核基因组的 GC 含量为 52.04%，重复 DNA 元件相对较少，仅占基因组的 2.10%。通过多种方法进行基因组注释，共鉴定出 11,779 个蛋白质编码基因，168 个 tRNA，60 个 rRNA 以及 30 个其他非编码 RNA。BUSCO 分析显示，该基因组具有较高的完整性，所含基因覆盖了 98.62% 的真菌单拷贝直系同源基因（BUSCOs），表明这是一个高质量的基因组组装。
3. 比较基因组分析：将 NJC07 与感染高粱的菌株 USPMTOX48 和感染甘蔗的菌株 BS2 - 1 进行基因组相似性和共线性分析。结果发现，NJC07 与 BS2 - 1 的基因组有 99.04% 的区域可比对（AP），核苷酸相似性达 93.89%（API）；与 USPMTOX48 的基因组有 91.48% 的区域可比对（AP），核苷酸相似性为 82.08%（API）。全基因组共线性分析表明，虽然这些基因组结构相似，但仍存在一些基因组重排现象。例如，NJC07 - contig 1 与 BS2 - 1 的多个 contigs 存在比对关系，暗示其可能包含至少三条染色体序列；NJC07 - contig 18 和 BS2 - 1 - contig 7 之间还存在倒位现象。这些重排可能与基因组的可塑性和病原菌的适应性进化有关。
4. 感染转录组分析：对感染玉米的 E. sorghinum 在 48 小时和 96 小时的转录组进行 RNA - Seq 分析，并与营养菌丝体进行比较。结果显示，在植物感染过程中，共有 7,794 个基因差异表达（，span data-custom-copy-text="\(q0.05\)"）。其中，48 小时时有 6,202 个差异表达基因（DEGs），96 小时时有 6,922 个 DEGs，且 48 小时和 96 小时共有 5,330 个 DEGs。在这些 DEGs 中，分别有 3,357 个和 3,658 个基因在 48 小时和 96 小时上调表达（，span data-custom-copy-text="\(q0.05\)"），这些上调基因可能在真菌侵染和定殖玉米植株的过程中发挥重要作用。

研究结论与讨论

本研究通过对 E. sorghinum 菌株 NJC07 的基因组和感染转录组测序分析，获得了高质量的基因组组装和丰富的转录组数据。这些数据揭示了该病原菌的基因组特征、与其他菌株的遗传差异，以及在感染玉米过程中的基因表达变化。研究成果为深入理解 E. sorghinum 的致病机制提供了关键信息，有助于进一步探究病原菌与玉米之间的分子互作关系。

从基因组角度来看，近乎完整的基因组组装以及详细的基因注释，为研究潜在的毒力 / 致病因子编码基因提供了重要资源，像效应蛋白（effectors）和碳水化合物活性酶（carbohydrate - active enzymes）等相关基因的确定，为后续功能研究指明了方向。比较基因组分析发现的基因组重排现象，为解释病原菌如何适应不同宿主提供了线索，这对于研究病原菌的进化和传播具有重要意义。

在转录组层面，感染过程中差异表达基因的鉴定，让我们初步了解到在不同感染阶段病原菌的基因调控情况。那些在感染过程中上调表达的基因，很可能参与了真菌对玉米的侵染、定殖以及致病过程，对这些基因功能的深入研究，有望找到防治玉米叶鞘斑病的新靶点。

总体而言，这项研究成果为玉米叶鞘斑病的防治策略开发提供了理论依据，在植物病理学领域具有重要的科学价值，对保障玉米安全生产、减少因病害造成的经济损失有着积极的推动作用。未来，基于这些数据，研究人员可以进一步开展功能验证实验，深入剖析病原菌的致病机制，为开发更有效的防控措施奠定坚实基础。