《npj 再生医学》损伤大小对体积性肌肉损失中局部和全身免疫细胞动力学的影响

　　

美国德雷塞尔大学（Drexel University）生物医学工程、科学与健康系统学院的 Ricardo Whitaker 等人在《npj 再生医学》（npj Regenerative Medicine）期刊上发表了题为 “Effects of injury size on local and systemic immune cell dynamics in volumetric muscle loss” 的论文。该研究对肌肉再生医学领域意义重大，深入探究了创伤性肌肉体积损失（Volumetric Muscle Loss，VML）后免疫细胞的变化机制，为改善肌肉修复效果、开发更有效的治疗策略提供了关键理论依据。

研究背景

VML 是一种因受伤或疾病导致大量肌肉缺失的致残性疾病，患者终身残疾相关费用高昂，目前的标准治疗方法 —— 物理疗法效果有限，而异种脱细胞细胞外基质（ECM）支架在临床试验中虽有一定前景，但仍远无法恢复 VML 前的肌肉功能，因此急需更有效的干预措施促进组织再生愈合。

巨噬细胞作为伤口愈合的主要调节者，在组织再生中起着关键作用。此前研究表明，ECM 衍生支架可促进小鼠 VML 的再生，使巨噬细胞向 Th2 相关表型转变；而聚己内酯（PCL）植入物导致的纤维化结局中，巨噬细胞则向 Th17 表型偏移。在纤维化损伤中，巨噬细胞同时高表达促炎因子（如肿瘤坏死因子 -α，TNFα）和促纤维化因子（如转化生长因子 -β，TGFβ），且再生相关标记物表达较低，但这些表型变化持续的时间及背后机制尚不明确，阻碍了针对性干预措施的设计。

此外，其他浸润免疫细胞会影响巨噬细胞表型，中性粒细胞可通过吞噬凋亡细胞（efferocytosis）影响巨噬细胞，但在 VML 中其对巨噬细胞表型的影响尚未完全明晰。并且，VML 对局部肌肉组织外的整个免疫系统的影响程度也不清楚，脾脏和骨髓来源的免疫细胞是损伤部位单核细胞来源巨噬细胞和其他白细胞的主要来源，关键尺寸的肌肉缺陷可能对这些免疫细胞储存器官产生系统性影响，进而影响白细胞向损伤部位的募集。基于以上种种未知，研究人员开展了此项研究，旨在评估纤维化与再生性肌肉修复中免疫细胞行为的局部和全身变化，探究纤维化结局中巨噬细胞功能障碍的潜在机制。

研究方法

1. 动物模型构建：选用雌性 C57BL/6 小鼠，经德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会批准后进行实验。在小鼠左后肢股四头肌处，使用 2mm 或 4mm 直径的活检打孔器制造全层损伤，2mm 缺陷可完全再生，4mm 缺陷则导致纤维化修复。

2. 细胞培养：获取 8 - 12 周龄雌性 C57BL/6 小鼠的股骨和胫骨，提取骨髓细胞进行培养。培养过程中使用含特定成分的培养基，3 天后换液，5 天后用 TrypLE 消化细胞并接种于 6 孔板，之后用 IL - 4、LPS 或 IL - 17A 对细胞进行极化处理，3 天后通过流式细胞术分析。

3. 中性粒细胞耗竭：通过尾静脉注射抗 Ly6G 抗体实现部分中性粒细胞耗竭，设置同型对照和 PBS 对照。在手术前及术后 1、2 天给药，通过流式细胞术确认肌肉中中性粒细胞的耗竭情况。

4. 组织处理与检测：对肌肉、脾脏、骨髓等组织进行处理，制备单细胞悬液用于后续检测。采用多种实验技术，如多维流式细胞术（检测免疫细胞数量和巨噬细胞表型）、多重基因表达分析（nanoString，研究基因表达变化）、多重细胞因子分析（Luminex，测量血清中免疫调节因子水平）、组织学和免疫组化（评估肌肉修复情况）等。

研究结果

1. 纤维化肌肉修复早期巨噬细胞行为改变：利用小鼠 VML 模型，观察到 28 天后纤维化组肌肉组织中胶原蛋白染色增多、总体肌肉质量降低、硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）含量升高。通过多维流式细胞术等方法检测发现，损伤后再生组和纤维化组肌肉中总髓细胞（CD45 +）和巨噬细胞（CD45 + B220 - CD3 - NK1.1 - Ly6G - F4/80 +）数量均显著增加，且纤维化组在第 3 天和第 28 天的巨噬细胞数量更多。
   

• 巨噬细胞表型差异：在巨噬细胞表型方面，纤维化组与再生组在损伤后第 1 天就出现差异且持续至第 28 天。纤维化组巨噬细胞中 CD9、CD38、PDL1、Arg1、CXCR4 等标记物表达较高，而 CD86、CD163、CD301b、CD206 等表达较低。通过多维分析还发现，第 7 天纤维化组巨噬细胞在特定簇（如簇 1 和簇 4）中数量较多，再生组则在簇 2、5 和 8 中数量较多。

• 基因表达差异：对分选的巨噬细胞进行 nanoString 基因表达分析，结果显示损伤后第 1 天，纤维化组巨噬细胞中与组织修复、ECM 重塑和修复性巨噬细胞表型相关的基因大多下调；第 3 天，纤维化组与再生组巨噬细胞基因表达仍存在差异，纤维化组高表达的基因与免疫细胞转运相关，低表达的基因与修复性巨噬细胞表型相关。对整个肌肉组织的基因表达分析表明，纤维化组在损伤后 6 小时就有与免疫细胞招募相关的趋化因子基因高表达，第 1 天和第 3 天分别有 Il36g 和 Tgfb1 等与纤维化 VML 相关的基因表达增加，同时 ECM 沉积和组装相关基因表达降低。此外，纤维化组在损伤后第 1 天的中性粒细胞数量几乎是再生组的两倍，且在不同时间点，两组的其他免疫细胞数量也存在差异。

2. 纤维化与再生结局组全身免疫反应的变化：研究人员对脾脏和骨髓中的巨噬细胞和单核细胞行为进行表征。结果显示，纤维化组小鼠骨髓中总髓细胞（CD45 +）数量较少，但第 7 天自然杀伤细胞较多，第 3 天巨噬细胞略有增多；脾脏中免疫细胞数量在两组间无差异，但纤维化组脾脏巨噬细胞在损伤后第 1 天就出现表型差异，且持续至第 7 天，其 CD38、CD86、PDL1 和修复标记物 CD206 表达较高。
   

• 血清细胞因子变化：分析血清中 32 种免疫反应相关细胞因子水平发现，损伤后第 1 天，纤维化组粒细胞集落刺激因子（GCSF）水平较高，而促炎细胞因子白细胞介素 - 1β（IL1β）、IL - 12（p70）和 IL - 15 水平较低；第 3 天，纤维化组中促纤维化 Th2 细胞因子 IL - 13 水平升高。

3. 纤维化结局中凋亡中性粒细胞增多：鉴于纤维化组中性粒细胞数量增加明显，研究人员进一步探究其表型。对第 3 天肌肉中分选的中性粒细胞进行基因表达分析，发现纤维化组与再生组仅有 2 个基因表达存在差异。检测肌肉中中性粒细胞凋亡和细胞死亡水平发现，损伤后 6 小时，纤维化组中性粒细胞数量和凋亡数量均增加，第 1 天虽中性粒细胞存活数量仍较多，但两组凋亡百分比无差异。

4. 部分中性粒细胞耗竭对巨噬细胞表型和肌肉修复结局无显著影响：考虑到凋亡中性粒细胞过多及清除障碍与纤维化和伤口愈合受损相关，研究人员假设中性粒细胞过多可能是纤维化结局中巨噬细胞功能障碍和组织修复受损的潜在介质。通过全身注射抗 Ly6G 抗体使纤维化组肌肉中中性粒细胞数量降至再生组水平，进行相关实验。
   

• 巨噬细胞表型：流式细胞术分析显示，中性粒细胞耗竭后第 3 天，损伤部位巨噬细胞的 PD - L1 表达增加，但其他表型标记物与同型对照组无差异。对分选的巨噬细胞进行基因表达分析发现，中性粒细胞耗竭对巨噬细胞表型影响极小，仅使 Il36g 相对于纤维化对照组（PBS）上调。

• 肌肉修复结局：在第 28 天评估肌肉修复结局，通过组织学和免疫组化检测发现，中性粒细胞耗竭组与纤维化对照组（PBS）在胶原蛋白染色、肌纤维直径和肌纤维面积方面均无显著差异。

研究结论与讨论

该研究揭示了小尺寸（再生性）和关键尺寸（纤维化）VML 损伤后，肌肉局部和全身免疫细胞行为存在众多差异。损伤后 1 天内，巨噬细胞表型即发生改变且持续 4 周；骨髓中白细胞数量、脾脏中巨噬细胞表型以及全身炎症细胞因子水平也有所变化；纤维化损伤局部中性粒细胞积累明显多于再生性损伤。然而，令人意外的是，部分中性粒细胞耗竭对巨噬细胞表型和肌肉修复结局几乎没有影响。

这些结果对于理解同一组织中不同大小损伤导致不同结局的免疫细胞相互作用动态机制至关重要，表明在设计新的干预措施时，必须考虑整个免疫系统的变化。以往认为关键尺寸缺陷组织修复受损主要是由于再生干细胞数量减少或细胞迁移的物理限制，而该研究表明功能失调的免疫细胞动态变化也起着重要作用。例如，纤维化损伤中巨噬细胞基因表达在第 1 天就广泛下调，影响组织修复和组织碎片清除，即使有足够的干细胞，也会抑制肌肉再生。

此外，研究还发现纤维化损伤存在全身性影响，而再生性损伤则没有。纤维化组血清中多种细胞因子发生改变，脾脏巨噬细胞更具炎症性，这表明损伤大小引起的早期炎症增加具有全身性影响，进而可能影响损伤部位的局部修复，但脾脏巨噬细胞对 VML 修复的具体作用仍有待进一步研究。

在巨噬细胞表型方面，研究发现纤维化组巨噬细胞并非过度促炎，而是在修复 / 再生行为上存在缺陷。与典型纤维化模型（如肝、肺纤维化）不同，纤维化 VML 损伤中的巨噬细胞表现出独特的表型特征，这可能与纤维化 VML 中细胞外基质沉积过少有关。

部分中性粒细胞耗竭对巨噬细胞表型和肌肉修复结局无显著影响，这表明中性粒细胞水平升高可能源于巨噬细胞行为缺陷，而非中性粒细胞自身行为异常。在其他组织（如糖尿病伤口）中，也存在凋亡中性粒细胞清除障碍与巨噬细胞活性缺陷相关的情况。并且，目前关于中性粒细胞耗竭对肌肉修复结局的影响尚无定论，需要更多研究加以明确。

该研究也存在一定局限性。实验采用的是相对无菌的损伤模型，与大多数 VML 患者的实际情况不同；VML 常伴有附近骨骼损伤，而本研究未考虑这一因素；组织消化过程可能影响中性粒细胞表型，且中性粒细胞耗竭方法可能间接调节肌肉巨噬细胞表型；此外，研究仅在雌性小鼠中进行，性别对研究结果的影响有待进一步探究。

总体而言，该研究在 VML 修复和病理研究方面取得了重要进展，为深入理解巨噬细胞在 VML 后的功能障碍提供了完整的时间线，强调了考虑整个免疫细胞相互作用系统对于改善 VML 肌肉修复结局的重要性，为后续研究和治疗策略的开发指明了方向 。