枯草芽孢杆菌不依赖胁迫体但依赖rsrt的环境胁迫感知

一些细菌利用一种大的蛋白质复合物，即应激体，来感知和应对环境压力。在这里，Khadka等人表明复合体中一个长期假定的传感器对于传感是必不可少的，而以前被认为仅仅是信使的蛋白质是至关重要的。

　　

美国俄克拉荷马州立大学（Oklahoma State University）微生物学和分子遗传学系的研究人员 Rabindra Khadka、Brannon Maravich 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Stressosome-independent but RsbT-dependent environmental stress sensing in Bacillus subtilis” 的论文。该研究对深入理解芽孢杆菌（Bacillus subtilis）应对环境压力的机制有着重要意义，有助于揭示细菌在复杂环境中生存和适应的奥秘，也为相关领域进一步研究细菌应激反应提供了新的思路和方向。

研究背景

细菌在自然界中常常面临各种波动的环境条件，这些条件很多都会给细胞带来压力。对于细菌来说，能否准确感知并适应这些压力，关乎它们的生存和繁衍。芽孢杆菌及相关革兰氏阳性菌进化出了多种方式来应对环境压力，其中由替代西格玛因子（sigma factor）调控的一般应激反应（General Stress Response，GSR）尤为重要。在芽孢杆菌中，能激活约 200 个基因组成的一般应激调节子，帮助细菌应对能量或环境压力，比如营养物质匮乏、盐胁迫、乙醇刺激等。

在芽孢杆菌中，的活性最终由 RsbVW 伴侣切换机制控制。在未受压力的细胞中，抗西格玛因子 RsbW 与结合，使其保持无活性状态。当细胞受到压力时，RsbV 去磷酸化，与 RsbW 结合，促使 RsbW 释放，进而激活相关基因。RsbV 的去磷酸化由 RsbP 和 RsbU 两种磷酸酶调控，能量压力激活 RsbP，环境压力激活 RsbU。而 RsbU 的磷酸酶活性又依赖于与 RsbT 的相互作用。

压力小体（stressosome）是一种存在于细胞质中的蛋白质复合物，由 20 个 RsbR 二聚体和 20 个 RsbS 蛋白组成，能够结合并隔离 RsbT。当细胞感受到压力时，RsbT 从压力小体中释放出来，激活下游的 RsbU，最终导致的激活。一直以来，人们认为 RsbR 蛋白可能是压力的传感器，然而，虽然有一些研究从结构和功能等方面进行了探索，但 RsbR 蛋白的传感功能一直缺乏直接的实验证据，真正的压力传感器身份也始终未知。因此，开展这项研究对于明确细菌压力感知机制至关重要。

研究方法

1. 菌株构建与培养：研究人员以芽孢杆菌 PY79 为基础菌株，通过转化或噬菌体转导构建了多种突变菌株。利用 pMiniMAD 载体进行无标记基因缺失和等位基因替换，构建缺失特定基因的菌株。同时，通过 PCR 扩增和等温组装技术构建携带特定基因的质粒，并转化到相应菌株中。培养菌株时，根据不同实验需求，在 LB - Lennox 琼脂平板或液体培养基中添加相应抗生素进行筛选和培养。
2. 互补实验：为了研究 RsbRA 在压力感知中的作用，研究人员采用互补策略。将野生型 rsbRA 和 rsbU 基因克隆到整合载体 pDG1730 上，转化到缺失其他 RsbR 同源物、rsbP 和 rsbU 的菌株中，通过蓝色 - 白色筛选和 β - 半乳糖苷酶活性检测，监测的活性。
3. 定点突变与等位基因替换：以 pDG1730 - rsbRA - rsbU 质粒为模板，使用定点突变试剂盒对 RsbRA 的假定传感结构域进行丙氨酸扫描突变。将突变后的质粒转化到相应菌株中，通过 β - 半乳糖苷酶活性分析突变对反应的影响。同时，利用 pMiniMAD 载体进行定点突变 rsbRA 的等位基因替换，在更接近天然状态下研究突变的影响。
4. 蛋白组学分析：对野生型、ΔrsbRAΔrsbS 和 RsbRARsbS菌株在乙醇处理前后进行蛋白组学分析。通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）技术，结合 MaxQuant 软件对蛋白质进行鉴定和定量，比较不同菌株中 Rsb 蛋白的表达情况。
5. 实时荧光定量 PCR（qRT - PCR）：收集不同处理时间点的菌株样本，提取总 RNA 并反转录为 cDNA，以 gyrB 基因为内参，通过 qRT - PCR 检测 rsbT 基因的表达水平，分析其在不同菌株和处理条件下的变化。
6. 微流控技术与荧光显微镜观察：利用微流控装置结合荧光显微镜，在单细胞水平观察压力小体缺失菌株对乙醇压力的响应。构建携带驱动的 mNeonGreen 荧光报告基因的菌株，在微流控芯片中进行培养和压力处理，通过成像和数据分析，研究单细胞的活性变化。

研究结果

1. 互补策略鉴定 RsbRA 在压力传感中的关键作用：研究人员以 RsbRA 为模型，对其 N 端结构域进行丙氨酸扫描突变。通过互补实验发现，许多突变影响了对 3% 乙醇的反应的时间和幅度，但没有得到完全丧失压力传感功能或组成型激活的突变体。这表明 RsbRA 的 N 端区域对反应有重要影响，但 RsbRA 可能并非直接的压力传感器。
2. RsbRA 点突变影响反应的时程和幅度：进一步对 RsbRA 进行定点突变和等位基因替换实验，结果显示不同位置的丙氨酸替换对反应产生了不同影响。部分突变降低或增加了反应的幅度，还有些突变改变了反应的时间。而且，这些突变菌株在不同压力条件下的反应表明，观察到的反应是真正的压力反应，并非基础反应的改变。
3. 缺失所有 RsbR 同源物的细胞仍保留乙醇应激诱导的反应：研究人员构建了缺失所有已知活性 RsbR 同源物的菌株，发现该菌株在 3% 乙醇应激下仍能产生明显的反应，且该反应延迟但更强、更持久。这一结果表明，RsbR 蛋白并非引发对乙醇压力反应的必需成分，压力小体可能在环境压力反应中并非不可或缺。
4. 缺失 RsbS 的细胞与缺失 RsbR 的细胞表现出相似的反应：RsbS 是压力小体中的支架蛋白，研究人员分别构建了缺失 RsbS 和同时缺失 RsbRA 和 RsbS 的菌株。结果发现，缺失 RsbS 的菌株与缺失 RsbR 的菌株在反应上表现相似，而同时缺失 RsbRA 和 RsbS 的菌株则对乙醇压力无反应。这表明 RsbS 在压力小体的功能中起到一定作用，同时也暗示 RsbT 可能在压力小体缺失的情况下发挥重要作用。
5. 阻断 RsbRA 和 RsbS 产生的细胞表现出长寿命、应激诱导的反应：为了进一步验证上述结论，研究人员通过引入提前终止密码子阻断 RsbRA 和 RsbS 的产生。结果显示，这些细胞在乙醇应激下表现出强烈、延迟且长寿命的反应，再次证明压力小体对于环境反应并非必需。
6. 压力小体缺失的细胞对其他环境应激源有反应并激活其他驱动的基因：研究人员测试了压力小体缺失的细胞对其他应激源的反应，发现它们对 0.6 M NaCl 有明显的反应，且反应的时间特征与对乙醇的反应相似。此外，通过检测另一个报告基因的反应，也证实了压力小体缺失的细胞能激活多个调控的基因。
7. RsbT 及其激酶活性是压力小体非依赖的反应所必需的：蛋白组学分析表明，缺失 RsbRA 和 RsbS 的菌株中 RsbT 蛋白水平显著降低，这解释了该菌株反应缺陷的原因。进一步构建缺失或翻译阻断 rsbT 的菌株，结果显示这些菌株在乙醇、NaCl 和酸应激下均无法激活。使用激酶失活的 RsbT（D78N）突变体进行实验，发现其也阻断了压力小体缺失细胞的活性，表明 RsbT 的激酶活性在压力小体非依赖的信号传导中很重要。
8. 压力小体缺失的细胞在单细胞水平表现出重复和幅度调制的反应：利用微流控技术和荧光显微镜在单细胞水平观察发现，压力小体缺失的细胞在 4% 乙醇应激下表现出脉动、重复的反应，且随着乙醇浓度增加，反应幅度增大，主要是通过单细胞的幅度调制实现的。这表明 RsbT 能够独立介导环境压力传感和反应。

研究结论与讨论

本研究通过一系列实验，对芽孢杆菌中压力小体在环境压力感知中的作用进行了深入探究。研究结果表明，压力小体并非环境压力感知和反应的必需组件，RsbT 在没有压力小体的情况下，能够独立介导环境压力传感和反应，并且其激酶活性在这一过程中起着重要作用。这一发现修正了以往认为压力小体是主要环境压力传感器的模型，为理解细菌应激反应机制提供了新的视角。

在以往的模型中，压力小体被认为是感知压力并激活 RsbT 激酶活性的关键组件，但本研究表明，即使没有压力小体，细菌仍能对环境压力产生有效的反应。研究人员推测，压力可能直接激活与压力小体结合的 RsbT，使其释放并激活下游的 RsbU，从而引发反应。压力小体可能主要起到调节反应强度和时间的作用，确保细菌在压力来临时能快速响应，压力解除后能及时关闭反应。

此外，虽然本研究暗示 RsbT 可能是压力传感器，但 RsbR 蛋白的传感作用仍不能完全排除。在其他细菌中，RsbR 的同源物能够感知氧气等信号，芽孢杆菌中的 YtvA 也能感知蓝光，因此 RsbR 蛋白在芽孢杆菌的压力感知中可能仍有潜在作用。而且，压力感知在不同物种和压力源下存在差异，这种复杂的调控机制可能使细菌能够更灵活地应对各种环境变化。

从单细胞水平的研究结果来看，压力小体缺失的细胞表现出的脉动、重复的反应，与以往观察到的某些仅含有一种 RsbR 同源物的菌株的反应相似，这可能意味着在这些菌株中 RsbT 也未被重新捕获，从而模拟了压力小体缺失的情况。这种脉动反应反映了激活和失活的内部动态，涉及正负反馈调节。

本研究为芽孢杆菌及相关细菌的应激反应机制研究开辟了新的方向，未来研究可以进一步探究 RsbT 感知压力的分子基础，以及 RsbT 与其他蛋白在压力小体缺失情况下的相互作用。这不仅有助于深入理解细菌在复杂环境中的生存策略，也可能为开发新型抗菌药物或生物技术应用提供理论依据。