重大突破！NAT10 介导 ENO1 mRNA 的 ac4C 乙酰化在非小细胞肺癌细胞糖酵解与凋亡中的关键作用解析

为解决非小细胞肺癌（NSCLC）治疗难题，湖南省第二人民医院的研究人员开展 NAT10 介导 ENO1 mRNA 的 ac4C 乙酰化在 NSCLC 中作用的研究，发现其调控糖酵解和凋亡。该成果为 NSCLC 治疗提供新思路，值得科研人员一读。

　　

湖南省第二人民医院（湖南省脑科医院）的研究人员 Yanqing Yuan、Na Li 等人在《BMC Pulmonary Medicine》期刊上发表了题为 “Role of NAT10-mediated ac4C acetylation of ENO1 mRNA in glycolysis and apoptosis in non-small cell lung cancer cells” 的论文。这篇论文在非小细胞肺癌（NSCLC^[1]）研究领域意义重大，为深入了解 NSCLC 的发病机制和探索新的治疗策略提供了关键线索。

研究背景

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中 NSCLC 占比超过 85%，患者 5 年生存率仅约 15.9%^[1]。近二十年来，多学科研究和技术进步加深了人们对 NSCLC 分子机制的理解，分子靶向治疗和免疫治疗也在一定程度上改善了患者预后。然而，靶向治疗仅对不到 25% 的患者有效，且治疗过程中普遍出现耐药现象；辅助化疗等其他治疗手段虽在不同阶段有一定生存益处，但超过半数患者会复发。因此，探寻新的 NSCLC 治疗方法迫在眉睫。

在细胞的生命活动中，转录后阶段的各种 RNA 修饰对 RNA 的稳定性、定位、转运和翻译起着关键作用^{[6 - 8]}。N4 - 乙酰胞苷（ac4C^[1]）是一种在真核生物和原核生物中都存在的保守乙酰化修饰。早期研究发现它主要存在于 tRNAs 和 18S rRNAs 上，后来又在 mRNAs 上大量发现。ac4C 在许多疾病中具有抗病毒和抗炎作用，更是癌症的潜在生物标志物，与多种癌症的发生、发展和预后相关。N - 乙酰转移酶 10（NAT10^[1]）作为一种核仁乙酰转移酶，是已知唯一能催化靶 RNA 发生 ac4C 修饰的酶。在 NAT10 及其辅助酶的催化下，ac4C 可促进 mRNA 稳定性、底物翻译和细胞增殖。此前研究表明，NAT10 可能是 NSCLC 的预后标志物和潜在治疗靶点，还能促进多种癌症的进展。

糖酵解是活细胞的常见代谢途径，在癌细胞中，糖酵解过程会增强，以满足其不断增长的能量需求。肿瘤糖酵解是癌症发生和发展的重要促进因素，高糖酵解活性与患者低总生存率相关。α - 烯醇化酶（ENO1^[1]）是一种存在于细胞表面和细胞质中的糖酵解酶，它能维持肿瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡，在肺癌进展中发挥着重要作用。然而，ENO1 的 ac4C 修饰在 NSCLC 中的作用却鲜为人知。基于以上背景，该研究旨在探究 NAT10 在 NSCLC 中的作用，以及下游基因 ENO1 在糖酵解和细胞凋亡中的机制，期望为 NSCLC 的治疗提供新策略。

研究方法

1. 生物信息学分析：利用伯明翰阿拉巴马大学癌症数据分析门户（UALCAN^[1]）数据库分析 NAT10 在正常组织与肺鳞状细胞癌（LUSC^[1]）、肺腺癌（LUAD^[1]）组织中的表达差异；通过 LinkedOmics 数据库查找与 NAT10 正相关和负相关的基因。
2. 细胞培养：从中国科学院细胞库购买 NSCLC 细胞系（H157、PC9、H460 和 A549）和人支气管上皮细胞（BEAS - 2B），在含有 10% 热灭活胎牛血清（FBS^[1]）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM^[1]）中，于 37°C、5% CO?的湿润培养箱中常规培养。
3. 细胞转染：合成 NAT10 短发夹（sh）RNA（sh - NAT10）、阴性对照 shRNA（sh - NC）、阴性对照过表达（oe - NC）和 ENO1 过表达（oe - ENO1）质粒。将细胞接种于六孔板，待细胞汇合度达到 80% 时，使用 Lipofectamine 2000 按照说明书进行转染，转染 48 h 后用逆转录 - 定量聚合酶链反应（RT - qPCR^[1]）检测转染效率。
4. RT - qPCR：用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA，逆转录成 cDNA 后，使用 Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix 进行 qPCR 扩增，通过 2^-ΔΔCT方法计算基因表达量。实验使用特定引物检测 NAT10、ENO1 和甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH^[1]）的表达。
5. 蛋白质免疫印迹法（Western blot）：用 RIPA 缓冲液裂解细胞提取蛋白质，BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度后，进行 10% SDS - PAGE 凝胶电泳，将蛋白质转移到 PVDF 膜上。用 5% 脱脂牛奶封闭后，依次与 NAT10、ENO1 和 β - 肌动蛋白（β - actin^[1]）的一抗、辣根过氧化物酶（HRP^[1]）标记的二抗孵育，最后用增强化学发光（ECL^[1]）底物显色，ChemiDoc 成像系统检测，Image J 软件分析条带强度，以 GAPDH 作为内参标准化蛋白质表达水平。
6. 细胞计数试剂盒 - 8（CCK - 8）检测：将细胞接种于 96 孔板，过夜贴壁后加入 CCK - 8 溶液，37°C 孵育 2 h，酶标仪在 450 nm 处测量吸光度，结果以与对照组相比的活细胞百分比表示，用于检测细胞活力。
7. 集落形成实验：将 A549 和 PC9 细胞消化计数后，以低密度接种于 6 孔板，培养 14 天后，固定、染色，拍照并计数集落数量，评估细胞增殖能力。
8. 凋亡率检测：用荧光素异硫氰酸酯（FITC^[1]）和碘化丙啶（PI^[1]）双染溶液，按照凋亡检测试剂盒说明书对 A549 和 PC9 细胞进行染色，使用 FACS CantoII 流式细胞仪检测，BD FACSDiva 软件分析细胞凋亡率，实验重复三次。
9. ¹⁸F - 氟脱氧葡萄糖（FDG^[1]）摄取实验：将细胞培养至 80 - 90% 汇合度，用含¹⁸F - FDG 的 DMEM 孵育 1 h，洗涤、收集细胞，制备细胞裂解液，用 γ 计数器测定放射性，BCA 法测定蛋白含量，结果以蛋白含量标准化，实验重复三次。
10. 乳酸生成量测定：将转染后的细胞接种于六孔板，培养 24 h 后收集培养基，离心去除细胞碎片，按照乳酸检测试剂盒说明书测定乳酸含量。同时裂解孔板中剩余细胞，测定蛋白浓度，将乳酸水平以蛋白含量标准化，实验重复三次。
11. 细胞外酸化率（ECAR^[1]）和氧消耗率（OCR^[1]）测定：使用 Seahorse XFe24 通量分析仪，分别利用糖酵解应激测试试剂盒和线粒体应激测试试剂盒检测 A549 和 PC9 细胞的 ECAR 和 OCR。细胞接种于 Seahorse XF 细胞培养微孔板，过夜贴壁后更换培养基平衡，依次注射特定化合物后检测，实验结束后裂解细胞测定蛋白含量，结果以蛋白含量标准化。
12. ac4C RNA 免疫沉淀（RIP^[1]）实验：按照试剂盒说明书进行实验，用 Protein A/G 磁珠结合抗 ac4C 抗体和兔 IgG 抗体，与细胞裂解液孵育，纯化 mRNA 后进行逆转录和 qPCR，检测靶 RNA 的结合情况。
13. 双荧光素酶报告基因实验：将含有 ENO1 全长 3’ - 非翻译区（UTR^[1]）的 cDNA 克隆到 pGL3 荧光素酶报告载体中构建野生型（WT^[1]）质粒，通过定点突变获得突变型（MUT^[1]）质粒。将 sh - NAT10 或 sh - NC 与 pGL3 - ENO1WT 或 pGL3 - ENO1MUT 共转染到 A549 和 PC9 细胞中，裂解细胞后用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性标准化，计算萤火虫 / 海肾荧光素酶活性比值作为相对荧光素酶活性。
14. RNA 稳定性评估：用放线菌素 D（Act D^[1]）处理 A549 和 PC9 细胞抑制 RNA 转录，在不同时间点（0、8、16 和 24 h）用 qPCR 检测 ENO1 表达，评估 RNA 稳定性。
15. 统计分析：使用 SPSS 21.0 软件和 GraphPad Prism 软件（v8.0.1）进行数据分析，数据以均值 ± 标准差（SD^[1]）表示，两组间比较用 Student’s t 检验，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA^[1]），P < 0.05 表示差异具有统计学意义。

研究结果

1. NSCLC 中 NAT10 高表达：通过 UALCAN 数据库的生物信息学分析发现，LUAD 和 LUSC 组织中 NAT10 的表达相较于正常组织上调。RT - qPCR 和 Western blot 检测结果显示，NSCLC 细胞系（PC9、A549、H460 和 H157）中 NAT10 的 mRNA 和蛋白质水平均高于 BEAS - 2B 细胞。基于此，后续实验选择 PC9 和 A549 细胞系。
2. 敲低 NAT10 抑制 A549 和 PC9 细胞的活力、糖酵解并促进细胞凋亡：将 sh - NAT10 转染到 A549 和 PC9 细胞系后，细胞中 NAT10 的 mRNA 和蛋白质水平下降。CCK - 8 实验表明细胞活力受到抑制，集落形成实验显示细胞增殖能力减弱，集落数量减少。流式细胞术检测发现细胞凋亡率增加。此外，沉默 NAT10 使 A549 和 PC9 细胞的¹⁸F - FDG 摄取、乳酸生成量、ECAR 和 OCR 均降低，说明敲低 NAT10 抑制了细胞的糖酵解过程。
3. ENO1 是 NAT10 介导的 ac4C 乙酰化在 A549 和 PC9 细胞中的下游调控靶点：LinkedOmics 数据库分析显示 ENO1 是与 NAT10 正相关的基因，且此前未在 NSCLC 中研究过，因其是糖酵解相关酶，故本研究将其作为 NAT10 的下游靶点。敲低 NAT10 后，A549 和 PC9 细胞中 ENO1 的 mRNA 和蛋白质水平降低。ac4C - RIP 实验表明，沉默 NAT10 使 ENO1 mRNA 的 ac4C 水平下降。双荧光素酶报告基因实验证实 NAT10 通过 ac4C 修饰与 ENO1 相互作用。RNA 稳定性实验显示，敲低 NAT10 加速了 A549 和 PC9 细胞中 ENO1 mRNA 的降解。
4. 过表达 ENO1 逆转 A549 和 PC9 细胞活力、糖酵解的下降及细胞凋亡的增加：与 oe - NC 组相比，oe - ENO1 组中 ENO1 的 mRNA 和蛋白质水平上调。CCK - 8 和集落形成实验表明，ENO1 过表达提高了细胞活力和增殖能力。流式细胞术检测发现，过表达 ENO1 降低了细胞凋亡率。同时，¹⁸F - FDG 摄取、乳酸生成量、ECAR 和 OCR 在过表达 ENO1 后均上调，表明 ENO1 过表达促进了细胞的糖酵解过程。

研究结论与讨论

研究表明，NAT10 在 NSCLC 细胞系中表达上调，敲低 NAT10 可抑制细胞活力和糖酵解，促进细胞凋亡，而过表达 ENO1 能逆转这些变化。这揭示了 NAT10 通过 ac4C 乙酰化修饰 ENO1，在 NSCLC 的糖酵解和细胞凋亡过程中发挥重要调控作用。NAT10 有望成为研究 NSCLC 发生发展的生物标志物，也可作为未来 NSCLC 治疗的潜在靶点。

此前研究虽已探索了 NAT10 在 NSCLC 中的致癌作用，但很少将其与糖酵解联系起来。本研究详细阐述了 NAT10 介导 ac4C 修饰调控 ENO1 表达和活性的机制，为理解 NAT10 驱动的 NSCLC 代谢重编程提供了新视角。开发针对 NAT10 或 ac4C 修饰的抑制剂，可能成为 NSCLC 临床治疗的新策略，将其与现有化疗或免疫治疗联合使用，或许能提高治疗效果。

不过，该研究也存在一定局限性。目前缺乏临床研究来探究 NAT10 表达与 NSCLC 患者生存率的关系，未来研究纳入更多 NSCLC 细胞系或原发性肿瘤样本，将有助于提高研究结果的普遍性。尽管如此，这项研究依然为 NSCLC 的研究和治疗开辟了新方向，随着后续研究的不断深入，有望为 NSCLC 患者带来更多希望，推动 NSCLC 治疗领域的发展。