噬菌体携带孤儿抗毒素样酶破解细菌DarTG1毒素-抗毒素防御系统的分子机制

为解决细菌毒素-抗毒素系统DarTG1对噬菌体DNA的ADP-核糖基化修饰抑制问题，Anna Johannesman等研究人员发现T4样噬菌体编码的孤儿抗毒素样酶AdfN（anti-DarT factor NADAR），通过其NADAR超家族ADP-核糖基糖水解酶活性逆转DNA修饰，揭示了噬菌体与宿主博弈中新型酶学防御策略的进化起源，为理解微生物互作提供了新视角。

　　

在微生物世界的军备竞赛中，细菌进化出复杂的防御系统对抗噬菌体侵袭，而噬菌体则发展出精妙的"反防御武器"。其中，细菌的毒素-抗毒素系统（TA）DarTG1通过毒素DarT1对噬菌体DNA进行ADP-核糖基化修饰（ADPr），阻断其复制，而抗毒素DarG1则在未感染时保护细菌自身DNA。尽管此前已知噬菌体通过非酶学机制（如AdfA蛋白）抵抗DarTG1，但T4噬菌体等Tevenvirinae亚科成员展现出不依赖AdfA的完全抗性，暗示存在未知防御策略。

为揭示这一谜团，研究人员通过噬菌体重组实验和CRISPR-Cas13筛选，在T4样噬菌体中鉴定出新型抗DarT因子AdfN。该蛋白属于NADAR（NAD和ADP-核糖）超家族，与细菌DarG1抗毒素结构相似但缺乏其N端延伸域。AlphaFold2结构预测显示AdfN保留关键催化残基（E36和K43），体外实验证实其能有效去除DNA上的ADPr修饰。有趣的是，AdfN在进化上呈现"孤儿抗毒素"特征——虽与DarG1同源却不直接结合DarT1，而是作为独立酶发挥作用。系统发育分析更发现，不同噬菌体（如T4、Bas32、Bas60）多次独立获得NADAR蛋白，分别源自细菌或古菌祖先，形成多分支进化谱系。

研究采用多项关键技术：

1. 噬菌体重组与CRISPR-Cas13筛选鉴定抗性基因
2. 细菌双杂交系统验证蛋白互作
3. AlphaFold2结构预测与DALI结构比对
4. 点 blot检测DNA ADP-核糖基化水平
5. 系统发育分析追踪NADAR蛋白进化起源

主要研究结果：

1. T-even噬菌体不依赖AdfA抵抗DarTG1
   通过17种Tevenvirinae噬菌体筛选发现，除RB69外所有成员均抵抗DarTG1，且抗性与adfA基因存在与否无关。细菌双杂交显示T4的AdfA^T4与DarT1结合弱于功能性AdfA^RB69(R164H)，解释其无效性。

2. AdfN作为核心抗性因子
   基因30.3（后命名AdfN）在抗性噬菌体中完整，而敏感株RB69因移码突变缺失C端α螺旋。删除adfN使T4和T2完全敏感，回补实验证实其充分必要性。

3. 酶学机制解析
   AdfN^T4催化突变体（E36A/K43A）仅部分恢复噬菌体增殖，体外实验显示野生型可清除DNA ADPr信号。但不同于DarG1，AdfN^T4无法在未感染细胞中中和DarT1毒性，提示需要噬菌体特异性辅助因子。

4. 跨物种NADAR功能保守性
   非T4类噬菌体（如Bas32、Bas60）的NADAR蛋白虽进化起源不同，均能逆转DarTG1防御且不依赖宿主因子，但对DarTG2（靶向胸苷）无效，证实底物特异性。

结论与意义：
该研究首次揭示噬菌体通过"盗用"宿主抗毒素酶实现防御突破的创新策略。AdfN代表首例裂解性噬菌体编码的孤儿抗毒素同源物，其进化呈现"模块化"特征——NADAR催化核心被反复招募，而调控域则根据噬菌体需求差异化演变。这种酶学防御比非酶学机制更具普适性，可抵抗不同结构的DarT变体。

更深层地，该发现拓展了对生物冲突中ADP-核糖基化作用的理解：从细菌TA系统到噬菌体反防御，再到真核生物免疫（如STING通路），这一古老修饰机制在跨界防御中持续创新。研究同时为合成生物学提供新工具，NADAR蛋白或可设计为基因编辑中DNA保护的分子开关。未来探索AdfN的噬菌体特异性激活因子，将有助于开发针对耐药菌的噬菌体疗法新策略。