《Cell Death and Disease》CircFUNDC1与CDK9相互作用，改善椎间盘退变

　　

浙江大学医学院附属邵逸夫医院骨科（Department of Orthopaedic Surgery, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine）的研究人员 Tianyuan Gu、Yong He 等在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “CircFUNDC1 interacts with CDK9 to promote mitophagy in nucleus pulposus cells under oxidative stress and ameliorates intervertebral disc degeneration” 的论文。这篇论文在椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration，IVDD）研究领域意义重大，为该疾病的治疗提供了全新的思路和潜在的治疗靶点。

研究背景

腰痛已成为全球性的重大健康问题，给社会带来了沉重的经济负担，并且随着人口老龄化的加剧，这一问题愈发严重。众多研究表明，腰痛与椎间盘退变密切相关。椎间盘退变过程中，髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）会逐渐流失。细胞外基质主要由胶原纤维和蛋白聚糖（如聚集蛋白聚糖）组成，主要由髓核细胞产生并维持，其中 SOX9、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白 II 等合成代谢因子起着关键作用。

细胞衰老与椎间盘退变的发生和发展紧密相连，主要由 p16-pRb 和 p21-p53 通路调控。在导致细胞衰老的众多因素中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）对线粒体功能障碍和细胞外基质恶化影响巨大。目前，传统的保守治疗和手术治疗虽广泛应用于缓解腰痛，但往往会产生各种不良反应。因此，开发既能解决临床症状又能针对病因的新型安全治疗方法迫在眉睫。

生物制剂因其安全性高、不易产生耐受性等优点，成为治疗椎间盘退变及其他退行性疾病的理想选择。近年来，长链非编码 RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）被发现是退变过程中的关键参与者。在各类长链非编码 RNA 中，环状 RNA（circular RNAs，circRNAs）因其独特的闭环结构脱颖而出，这种结构使其稳定性极高，能够抵抗核酸外切酶的降解，是极具潜力的生物制剂。

环状 RNA 分为细胞质环状 RNA 和细胞核环状 RNA，二者功能各异。细胞质环状 RNA 常作为竞争性内源性 RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）与微小 RNA（microRNAs，miRNAs）相互作用，在椎间盘退变研究中已被广泛探讨。而细胞核环状 RNA 可直接与各种核蛋白结合，调控基因表达，但在椎间盘退变领域的研究较少。研究人员在前期研究中发现一种名为 hsa_circFUNDC1（即 circFUNDC1）的细胞核环状 RNA，在终末期椎间盘退变患者的髓核细胞中显著下调，且它来源于编码 FUN14 结构域蛋白 1（FUN14 domain-containing 1，FUNDC1）的基因，FUNDC1 对线粒体自噬（mitophagy）和细胞存活至关重要。基于此，研究人员推测 circFUNDC1 与椎间盘退变的发病机制相关，并对其在髓核细胞和椎间盘维持中的功能展开研究。

研究方法

1. 细胞和组织的分离与培养：从 150 例接受椎间盘切除术的患者（88 名男性，62 名女性）废弃样本中获取人髓核组织，经伦理委员会批准后，用于 RNA 提取、体外培养和髓核细胞分离。将髓核组织切成小块，用含 0.1% II 型胶原酶的 DMEM 培养基消化，过滤、离心后，在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中培养。同时，从 8 周龄雄性 Sprague Dawley 大鼠腰椎间盘分离大鼠髓核细胞，用 0.1% II 型胶原酶消化后，在 DMEM/F12 培养基中培养。此外，培养 HEK-293T 细胞用于相关实验。

2. 构建动物模型：选取 24 只 8 周龄雄性 Sprague Dawley 大鼠，随机分为实验组和对照组。实验组大鼠经麻醉后，在荧光镜引导下，用 18 号针穿刺椎间盘，随后每隔 14 天向手术椎间盘注射携带 circFUNDC1 的腺病毒；对照组大鼠不进行手术干预，部分注射腺病毒，部分注射 NC 腺病毒。术后 4 周，用过量水合氯醛处死大鼠。

3. 检测技术：运用核酸电泳、荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization，FISH）、RNA 提取及相关处理、逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、双荧光素酶报告基因检测、蛋白质免疫印迹（Western blotting）、流式细胞术、苏木精 - 伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色、阿尔新蓝（Alcian blue）染色、番红 O / 固绿（Safranin-O/fast green）染色、高密度细胞培养、分子对接、RNA 下拉实验、银染、质谱分析、RNA 免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）、染色质免疫沉淀（CUT & Tag chromatin immunoprecipitation）、免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）、衰老相关 β - 半乳糖苷酶（Senescence-associated β -galactosidase，SA-β-Gal）染色、共聚焦显微镜等多种技术，对相关指标进行检测和分析。

研究结果

1. circFUNDC1 在终末期 IVDD 中显著下调：椎间盘退变分为五个临床等级，通过 qPCR 检测发现，与 I 级样本相比，V 级髓核细胞中 circFUNDC1 表达显著下降，FISH 实验进一步证实了这一结果。

2. circFUNDC1 主要定位于 NPCs 的细胞核：circFUNDC1 由 FUNDC1 mRNA 的外显子 4 和部分外显子 5 反向剪接形成，经 Sanger 测序、PCR 分析和 RNase R 处理实验确认其身份。qPCR 和 FISH 分析表明，circFUNDC1 主要存在于细胞核中。

3. circFUNDC1 参与 ECM 的稳态维持：利用反义寡核苷酸（antisense oligos，ASOs）敲低 circFUNDC1 表达后，NPCs 中合成代谢因子 Sox9、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白 II 的 mRNA 和蛋白质水平下降，高密度培养的 NPCs 中蛋白聚糖产生受抑制。通过腺病毒感染过表达 circFUNDC1，能剂量依赖性地增加蛋白聚糖产生，提高合成代谢因子水平。

4. circFUNDC1 与转录调节因子 CDK9 相互作用：通过质谱分析、免疫沉淀、RNA 下拉实验和免疫荧光等实验证实 circFUNDC1 与 CDK9 相互作用。circFUNDC1 的片段 2 与 CDK9 结合至关重要，分子对接预测了二者结合的关键核苷酸和氨基酸残基。预测分析显示 circFUNDC1 不太可能作为 miRNA 海绵发挥作用。

5. circFUNDC1-CDK9 复合物激活 FUNDC1 启动子：RNA-Seq 分析表明，过表达 circFUNDC1 可显著上调 FUNDC1 mRNA 转录。CUT & Tag 染色质免疫沉淀实验发现 CDK9 在 FUNDC1 启动子区域富集。双荧光素酶报告基因检测显示，circFUNDC1 和 CDK9 协同作用，激活野生型 FUNDC1 启动子的荧光素酶活性。

6. FUNDC1 蛋白和 circFUNDC1 RNA 促进线粒体自噬保护 NPCs：敲低 FUNDC1 会降低合成代谢因子表达，过表达 FUNDC1 则产生相反效果。在氧化应激条件下，过表达 circFUNDC1 可挽救线粒体缺陷，促进线粒体自噬，减少 ROS 产生，抑制细胞衰老。

7. circFUNDC1 防止人髓核在体外培养中退变：在人髓核体外培养实验中，过表达 circFUNDC1 可增加 FUNDC1 蛋白表达，减轻过氧化氢对髓核的退行性影响，恢复合成代谢因子和线粒体标记物表达，抑制衰老标记物表达。在大鼠实验中，虽 circFUNDC1 过表达效果不明显，但推测其在大鼠体内的作用机制可能与人类不同。

研究结论与讨论

本研究首次揭示了细胞核定位的 circFUNDC1 在人髓核中的保护作用。研究表明，circFUNDC1 水平与椎间盘退变疾病严重程度呈负相关，它可通过减轻氧化应激对细胞外基质产生、线粒体功能和细胞衰老的负面影响，延缓椎间盘退变，是极具潜力的椎间盘退变治疗靶点。

研究还发现 circFUNDC1 与细胞核转录延伸主调节因子 CDK9 之间存在新的相互作用。这种相互作用首次证明了 circRNA 可直接结合 CDK9 并影响其对特定基因的活性，表明 circRNA 在转录调控中的作用可能比之前认为的更重要，为开发基于 circRNA 的治疗方法提供了理论依据。

此外，circFUNDC1 可招募 CDK9 至其亲本基因 FUNDC1，增加 FUNDC1 蛋白表达，促进线粒体自噬，减少活性氧积累，保护髓核细胞免受氧化应激损伤。然而，本研究存在一定局限性，如缺乏合适的动物模型深入探究 circFUNDC1 的功能，其在大鼠体内的具体机制尚不明确，CDK9 促进 FUNDC1 基因转录的具体机制也有待进一步研究。

总体而言，该研究为椎间盘退变的发病机制提供了新的见解，circFUNDC1 有望成为预防、延缓或治疗椎间盘退变的新型 RNA 生物制剂，为未来的研究和治疗开辟了新方向。