重大突破！探究女性肺腺癌患者肺菌群微环境：从良性病变到浸润性腺癌的关键奥秘

为解决女性肺腺癌早期诊断难、预后差的问题，山东大学齐鲁医院的研究人员开展女性肺腺癌患者肺菌群微环境研究。结果发现浸润性腺癌肺菌群有独特结构和功能变化。这为该病诊疗提供新方向，值得科研人员一读。

　　

山东大学齐鲁医院（Qilu Hospital of Shandong University）的研究人员程程杜（Cheng-Cheng Du）、孙大千（Da-Qian Sun）等人在《BMC Cancer》期刊上发表了题为 “Study of the microenvironment of the lung flora in female lung adenocarcinoma patients: from benign lesions to invasive lung adenocarcinomas” 的论文。这篇论文在女性肺腺癌研究领域意义重大，为深入了解肺腺癌的发展机制以及探寻新的诊断和治疗方法提供了重要依据。

研究背景

世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的 2022 年全球癌症数据显示，肺癌是全球最常见的癌症之一，发病率和死亡率都很高。其中，女性患者的发病率呈上升趋势，这可能与环境暴露、职业和污染等因素有关，比如室外环境空气污染加剧以及家庭使用固体燃料等。肺腺癌是女性中最常见的肺癌类型，而且通常在晚期才被诊断出来，治疗效果和预后较差，五年生存率甚至低于 20%。因此，寻找更精确、个性化的诊断和治疗方法迫在眉睫。

随着微生物检测技术的进步，越来越多的研究揭示了微生物群落与人类健康和疾病之间的密切关系，尤其是微生物在癌症发展中的潜在作用。目前的研究表明，肺菌群和肠道菌群（gut-lung axis，肠 - 肺轴）之间存在关联 。不过，大多数菌群研究集中在肠道菌群上，直接针对肺菌群与肺癌发生、发展和治疗的研究较少。在这样的背景下，本研究旨在通过对不同阶段女性肺癌患者术后样本进行 16S RNA 测序，探索肺菌群的多样性、组成和功能特征，揭示肺菌群在肺癌发展中的作用，并寻找潜在的生物标志物用于肺癌的诊断和治疗。

研究方法

1. 研究对象筛选：该研究获得了齐鲁医院伦理委员会（KYLL - 2022 (ZM)-1121）的批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的伦理准则，所有患者均签署了知情同意书。研究纳入了 2021 年 10 月至 2022 年 10 月在山东大学齐鲁医院接受肺叶切除术或部分切除术的 79 名成年女性。这些患者生活规律，无吸烟史、无污染物接触史，且不受其他特定风险因素影响。同时，排除了样本组织不足、术前接受抗肿瘤治疗、术前接受激素或免疫抑制治疗以及样本采集和储存过程中受到污染等情况。
2. 样本采集：在无菌条件下从肺组织采集样本，选取距离肿瘤边缘至少 3 - 5 厘米的约 1 立方厘米正常肺组织样本。采集后，样本在 PBS 缓冲液中清洗，以去除血液样本、杂质和非必要组织，然后迅速转移到 1.8 毫升无菌冷冻管中，用液氮速冻并密封保存。
3. DNA 提取和测序：使用 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，并储存在 - 20℃。通过 NanoDrop 微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳验证 DNA 的纯度和完整性。利用特定引物扩增 16S rRNA 基因的 V3 - V4 区域，使用 AxyPrep DNA 凝胶提取试剂盒回收扩增的 DNA 片段。随后，使用 ABI StepOne Plus 实时 PCR 系统对扩增子进行定量分析。最后，将纯化的扩增产物等量混合，在 Illumina 测序平台上进行双端测序（PE250 模式），以获得高质量的测序数据。
4. 数据处理：对测序数据进行质量控制和聚类、操作分类单元（OTU，operational taxonomic unit）聚类以及去除嵌合体等处理。通过与 SILVA 数据库进行物种注释，并借助综合微生物基因组（IMG）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和病原体系统资源整合癌症数据库（PATRIC）进行功能预测。利用 BugBase 软件和 PICRUSt2 软件进一步分析微生物的表型分类和代谢途径。
5. 统计分析：使用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，借助 Omicsmart 平台进行生物信息学分析。通过该平台比较不同组之间的 α 多样性指数、β 多样性指数、微生物物种丰度和功能丰度差异。两组之间的比较采用 t 检验和 Wilcoxon 秩和检验，多组之间的比较采用 Kruskal - Wallis 检验，多组比较后的事后检验采用 Tukey’s HSD 检验，P < 0.05 被认为具有统计学意义。

研究结果

1. 患者特征：本研究共收集了 79 例肺组织样本，其中良性病变肺组织（BD - L）7 例，包括 4 例非典型腺瘤样增生、2 例慢性炎症和 1 例硬化性肺泡细胞瘤；原位腺癌肺组织（AIS - L）16 例；微浸润腺癌肺组织（MIAL）31 例；浸润性腺癌肺组织（IAC - L）25 例。患者的中位年龄为 58 岁，43 例患者年龄超过 60 岁。
2. 序列分析结果：经过严格的质量控制，从初步测序产生的 10,086,956 条读段中筛选出 10,071,206 条高质量读段。进一步组装和质量筛选后，获得 9,915,124 条干净标签。在聚类分析阶段，识别并排除了 1,513,843 条嵌合标签，最终获得 8,401,281 条高质量有效标签，占原始读段的 83.29%，为后续生物信息学分析提供了坚实的数据基础。
3. α 多样性分析：α 多样性指数是反映样本菌群多样性的关键指标，Chao1 和 ACE 指数用于评估样本菌群的丰富度，Shannon 和 Simpson 指数综合了物种丰富度和分布均匀度。结果显示，从良性病变到浸润性腺癌，Chao1 和 ACE 指数逐渐降低；Shannon 和 Simpson 指数在病变早期变化不明显，但在浸润性腺癌阶段显著下降。这表明，在疾病发展到浸润性腺癌阶段时，患者肺菌群的多样性明显降低（p < 0.001）。
4. β 多样性分析：研究使用主坐标分析（PCoA）、UniFrac 距离指数和非加权距离指数综合评估不同疾病阶段肺样本细菌群落结构的差异。PCoA 分析结果显示，良性病变、原位癌和微浸润癌阶段的样本在菌群结构上具有较高的相似性，而浸润性腺癌样本的菌群结构与其他病变类型有显著差异。Adonis 检验进一步证实，在非加权 UniFrac 距离分析中，仅原位腺癌与微浸润腺癌、微浸润腺癌与浸润性腺癌之间菌群结构存在显著差异；在加权 UniFrac 距离分析中，只有微浸润腺癌与浸润性腺癌之间有显著差异。这表明浸润性腺癌的肺菌群结构与其他病变类型明显不同，而良性病变、原位腺癌和微浸润腺癌之间的菌群结构差异不显著。
5. 物种组成分析：通过物种分布堆叠图分析肺组织菌群组成，在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）在肺癌发展不同阶段的丰度变化不显著，但放线菌门（Actinobacteria）在浸润性腺癌阶段显著减少（p < 0.001）。在属水平上，嗜麦芽窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、伯杰菌属（Bergeyella）和土壤杆菌属（Pedobacter）的丰度在肺癌发展过程中保持稳定；而代尔夫特菌属（Delftia）、农杆菌属（Agrobacterium）、柄杆菌属（Caulobacter）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、罗尔斯顿菌属（Ralstonia）和阿菲波菌属（Afipia）在浸润性腺癌阶段显著减少；芽孢杆菌属（Bacillus）在浸润性腺癌患者中的丰度则显著增加（p < 0.05）。
6. 功能分析：利用 BugBase 软件分析不同阶段肺腺癌的微生物表型特征，发现与早期肺腺癌相比，浸润性腺癌阶段含有移动元件、形成生物膜、兼性厌氧、耐氧化应激和具有致病性的微生物数量显著增加，而需氧和厌氧表型的微生物丰度大幅降低。使用 PICRUSt2 软件预测不同阶段肺腺癌的代谢途径功能，结果显示随着肺腺癌的进展，代谢途径的丰度总体下降，在浸润性腺癌阶段尤为明显。

研究结论与讨论

本研究发现，浸润性肺腺癌患者的肺菌群在物种丰度、多样性、菌群功能和代谢途径等方面具有显著特征。α 多样性分析表明，随着肺腺癌的进展，肺菌群的丰富度逐渐降低，菌群多样性在疾病发展到浸润性腺癌阶段受到显著影响。这可能与癌症发展过程中肺微生态环境的改变有关，也进一步支持了异常肺微菌群可能在肺癌发生中起作用的观点，比如反复使用抗生素会增加肺癌风险，暗示肺微菌群失衡与肺癌之间存在联系。

β 多样性分析显示，在肺腺癌发展早期，肺菌群结构相对稳定，但到了浸润性腺癌阶段，菌群结构发生显著变化。这种变化可能导致微生物群落失衡，而微生物群落失衡与致癌过程直接或间接相关，它会影响个体的易感性，可能引发细胞异常增殖或肿瘤形成，包括调节宿主的免疫和炎症反应以及产生潜在致癌代谢物等。

在物种组成方面，门水平上主要菌群变化不大，只有放线菌门在浸润性腺癌患者中丰度下降；属水平上部分菌属在浸润性腺癌阶段才出现显著变化，芽孢杆菌属的增加可能与机体的抗肿瘤反应有关，未来研究可进一步深入探讨其作用机制。不同阶段肺中特征性优势菌属可能参与肺癌的发展过程，有望成为肺癌诊断和治疗的新生物标志物或生物靶点。

功能组成改变方面，浸润性腺癌中细菌具有更多含移动元件、形成生物膜和耐氧化应激等特征，这是微生物对癌症微环境的适应性反应，有助于细菌在肿瘤微环境中生存、逃避免疫系统识别和清除，还可能促进肿瘤的存活和进展。同时，浸润性腺癌中致病表型细菌丰度增加，提示疾病进展过程中肺菌群的致病潜力增强；而需氧和厌氧菌群减少、兼性厌氧菌群增加，表明兼性厌氧细菌可能更适应肺癌环境的代谢和氧化应激变化。代谢途径方面，随着肺腺癌进展，代谢途径丰度下降，可能与肺菌群多样性降低有关，说明肿瘤进展对肺微生物组的代谢功能产生了负面影响。

不过，本研究受时间因素限制，样本量有限，可能影响了研究结果的统计学意义。未来研究需要增加样本量，并采用更先进的分析技术来克服这些问题。对肺微生物组的全面研究有助于提高女性肺腺癌的诊断和治疗效果，通过分析微生物群落组成的变化，有望找到与肺腺癌发展和进展相关的微生物物种或代谢物，作为早期诊断的标志物，实现对高危女性的高效筛查和早期干预。这项研究为肺微生物学与肺腺癌之间的联系提供了新的见解，也为开发新的诊断策略和治疗方法奠定了基础，具有重要的临床意义和潜在应用价值。