RIPK3 在急性髓系白血病中的关键作用：关联特定亚型、预后及治疗抉择的前沿研究

为探究 RIPK3 在急性髓系白血病（AML）中的作用，江苏大学附属人民医院研究人员开展相关研究。结果发现 RIPK3 过表达与 AML 特定亚型、预后相关且可指导治疗。推荐阅读，助您把握该领域前沿进展！

　　

江苏大学附属人民医院（Department of Hematology, The Affiliated People’s Hospital of Jiangsu University）的研究人员在《BMC Cancer》期刊上发表了题为 “Overexpression and oncogenic role of RIPK3 in acute myeloid leukemia associated with specific subtypes and treatment outcome” 的论文。这篇论文在急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）研究领域意义重大，为深入了解 AML 的发病机制、预后评估以及治疗方案的选择提供了新的思路和理论依据。

研究背景

AML 是一种极具侵袭性的克隆性造血系统恶性肿瘤，具有显著的遗传和分子异质性。以往，AML 主要依据法美英（French-American-British，FAB）标准进行诊断和分类，FAB 亚型会对临床结局产生影响。如今，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）分类法因其在遗传和分子层面的深入认知，在临床上得到广泛应用。欧洲白血病网（European LeukmiaNet，ELN）风险分类表明，遗传和分子异常与 AML 的预后紧密相关，并且会左右治疗决策。因此，寻找 AML 的新型生物标志物，对于实现更精准的诊断、评估患者临床预后以及制定更合理有效的治疗方案至关重要。

受体相互作用蛋白激酶 3（Receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）作为丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶，是坏死小体 RIPK1 - RIPK3 - MLKL（mixed lineage kinase domain-like，混合谱系激酶结构域样）复合物的关键组成部分。已有研究显示，RIPK3 在坏死性凋亡、线粒体代谢、活性氧（ROS）生成、自噬和细胞增殖等过程中发挥着重要作用，其作用机制包括通过激活 MLKL 的经典途径以及激活炎症小体和产生细胞因子的非经典途径。同时，RIPK3 也参与了多种人类癌症的发病过程。然而，由于 RIPK3 信号在靶细胞内外以及微环境（免疫系统）中作用复杂，其在癌症发病机制中的功能尚不明确，在不同癌症中既有抑癌作用，也有促癌作用。在 AML 领域，虽然有少量研究报道了 RIPK3 在特定亚型中的表达和潜在作用，但对于其在整个 AML 队列中的表达模式和潜在作用，人们知之甚少，对 RIPK3 信号在 AML 发病机制中的具体作用也有待深入探究。

研究方法

1. 公共数据集筛选：研究人员从 cBioPortal 下载了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据集的 173 例 AML 患者数据，这些患者的 RIPK 家族成员（RIPK1/RIPK2/RIPK3/RIPK4）表达信息可获取，利用 GEPIA 分析 RIPK1 - RIPK4 在 AML 患者与对照组中的表达差异。
2. 细胞实验：选用多种人类白血病细胞系（如 K562、KG - 1 等）和人骨髓基质细胞系 HS - 5 进行实验。细胞培养于含 10% 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 RPMI - 1640 培养基中，在 37°C、5% CO?的培养箱中培养，并添加青霉素和链霉素，定期更换培养基。
3. 患者样本采集：纳入 39 例初诊 AML 患者和 32 例年龄匹配的健康个体作为验证队列。在患者和健康个体签署知情同意书后，采集骨髓（Bone marrow，BM）样本，通过梯度离心法分离 BM 单核细胞（BM mononuclear cells，BMMNCs）。
4. 分子生物学实验：采用 TRIzol 试剂提取总 RNA，逆转录合成 cDNA。运用实时定量 PCR（Real-time quantitative PCR，RT - qPCR）检测 RIPK3 和内参基因 GAPDH 的 mRNA 水平，使用特定引物并依据 2-ΔΔCt 法计算相对表达量。通过蛋白质免疫印迹（Western blot）测定 RIP3 蛋白水平，用 RIPA 裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后进行电泳、转膜，与特异性抗体孵育后化学发光检测。
5. 生物信息学分析：依据 | log?FC|>1.5、FDR<0.05 和 P<0.05 的条件筛选差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs，包括 mRNAs 和 lncRNAs）和差异表达 miRNAs（Differentially expressed miRNAs，DEmiRs）。
6. 基因干扰实验：设计并合成针对 RIPK3 的 siRNA 序列，筛选出有效序列后构建到质粒并包装成慢病毒感染细胞，以敲低 RIPK3 的表达。
7. 细胞功能实验：运用 CCK8 法检测细胞活力，细胞周期实验分析细胞周期分布，集落形成实验评估细胞克隆形成能力，Transwell 迁移实验测定细胞迁移能力。
8. 统计分析：使用 SPSS 20.0 和 GraphPad 5.0 软件进行统计分析。临床参数分析中，分类变量和连续变量分别采用 Pearson 卡方检验 / Fisher 精确检验和 Mann - Whitney U 检验 / Kruskal - Wallis 检验；功能实验数据分析采用 Student t 检验和双向方差分析；生存分析运用 Kaplan - Meier 法（log - rank 检验）和 Cox 回归（比例风险模型）；通过受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线和曲线下面积（Area under the ROC curve，AUC）评估 RIPK3 表达对 AML 患者和对照组的区分能力，P<0.05 为差异具有统计学意义。

研究结果

1. RIPK3 过表达与 AML 预后的关系：利用 GEPIA 分析发现，与对照组相比，AML 患者中 RIPK3 表达显著上调，而 RIPK1、RIPK2 和 RIPK4 表达无明显差异。进一步相关性分析显示，AML 中 RIPK1 与 RIPK2、RIPK3 表达呈显著正相关，RIPK2 与 RIPK3 无显著相关性。Kaplan - Meier 分析表明，在所有 AML 患者和非 M3 型 AML 患者中，只有 RIPK3 过表达与较短的总生存期（Overall survival，OS）和无病生存期（Disease - free survival，DFS）显著相关，而 RIPK1 和 RIPK2 对 OS 和 DFS 无明显影响。
2. RIPK3 在 AML 中的表达验证：对 39 例初诊 AML 患者和 32 例对照的 BMMNC 样本进行 RT - qPCR 检测，结果显示 AML 患者中 RIPK3 转录水平显著高于对照组。ROC 分析表明，RIPK3 表达可作为区分 AML 患者和对照组的潜在生物标志物，AUC 值为 0.6867。
3. RIPK3 过表达与 AML 特定亚型的关联：对比 TCGA 数据集中低 RIPK3 表达组和高 RIPK3 表达组 AML 患者的临床病理特征，发现两组在常见外周血细胞计数、性别、年龄和原始细胞计数等方面无显著差异，但在 FAB 分类、核型分类和分子 / 细胞遗传学风险分类上存在显著差异。高 RIPK3 表达更易出现在 FAB - M4/M5 亚型、正常核型和细胞遗传学中等风险组，而在 FAB - M2 亚型、t (8;21)、inv (16) 和细胞遗传学 / 分子低风险组中较少出现。在常见基因突变方面，高 RIPK3 表达与 NPM1 突变和 RUNX1 野生型密切相关。对不同 FAB 亚型、核型分类、分子 / 细胞遗传学风险组以及有无 NPM1/RUNX1 基因突变的 AML 患者进行 RIPK3 表达分析，结果显示在 FAB - M4/M5 亚型、正常核型、NPM1 突变等情况下，RIPK3 表达存在显著差异。此外，AML - M4/M5 细胞系的 RIPK3 转录水平和蛋白表达均显著高于其他亚型细胞系。
4. RIPK3 表达对 AML 治疗选择的指导作用：分析 TCGA 数据集中 HSCT（Hematopoietic stem cell transplantation，造血干细胞移植）对不同 RIPK3 表达水平 AML 患者预后的影响，发现在高 RIPK3 表达组中，接受 HSCT 的 AML 患者在总 AML 和非 M3 AML 亚组中的 OS 和 DFS 均显著长于仅接受化疗的患者；而在低 RIPK3 表达组中，HSCT 和化疗组在 OS 和 DFS 上无明显差异。这表明 RIPK3 表达可用于指导 AML 患者在诱导治疗阶段选择 HSCT 还是化疗。
5. 与 RIPK3 过表达相关的分子特征：比较 TCGA 数据集中低 RIPK3 表达和高 RIPK3 表达的 AML 样本转录组，共鉴定出 847 个差异表达的 mRNAs/lncRNAs 和 14 个差异表达的 miRNAs。GO 分析显示，这些差异表达基因参与细胞分化等多个生物学过程。其中，下调 / 正相关基因如 TP53INP2、ITGA7 和 miR - 10a 在 AML 中具有致癌作用并与预后相关；上调 / 负相关基因如 miR - 195 具有抗白血病作用且对 AML 预后有提示意义。
6. RIPK3 在 AML 中的致癌作用验证：在 OCI - AML3 和 NOMO - 1 细胞系中进行 RIPK3 基因敲低实验，通过 RT - qPCR 和 Western blot 验证敲低效果。结果显示，敲低 RIPK3 后，OCI - AML3 和 NOMO - 1 细胞系的增殖明显受到抑制，可能是由于细胞周期阻滞在 G0/G1 或 S 期。同时，细胞的克隆形成能力和迁移能力也显著受损，表明 RIPK3 在 AML 中具有潜在的致癌作用。

研究结论与讨论

本研究表明，RIPK3 在 AML 患者中表达显著增加，且在 FAB - M4/M5 亚型中极度上调。体外功能研究证实了 RIPK3 在 AML - M4/M5 细胞系中的潜在生物学效应，支持了其在 AML 中的致癌作用。然而，RIPK3 在不同 AML 亚型中的作用存在差异，在某些亚型中可能具有抑癌功能，这可能与临床患者的遗传和分子异质性有关。

尽管此前关于 RIPK3 在 AML 预后作用的报道较少，但在多种实体瘤中，RIPK3 已显示出重要的预后价值。本研究首次揭示了 RIPK3 表达在 AML 中的预后价值，其有望成为指导 AML 治疗选择的潜在生物标志物，但在临床常规应用前，仍需进一步研究验证。

此外，虽然先前研究初步揭示了 RIPK3 表达的调控机制，包括转录因子和表观遗传修饰的调控，但本研究未观察到 RIPK3 与这些调控基因的关联，这可能是由于不同疾病的异质性所致。未来需要进一步探究 RIPK3 在白血病发生过程中的表达和激活调控机制。

综上所述，RIPK3 过表达与 AML 的特定亚型（如 FAB - M4/M5、正常核型和 NPM1 突变）相关，可能促进白血病的发展。RIPK3 过表达还与不良预后相关，并可能指导 AML 的治疗选择。该研究为 AML 的研究和治疗开辟了新的方向，为深入理解 AML 的发病机制和优化治疗策略提供了重要依据 。