带电底物处理增强T细胞介导的癌症免疫治疗

　　

带电底物处理增强 T 细胞介导的癌症免疫治疗

摘要：生物物理信号在 T 细胞生物学中起着至关重要的作用，然而其在过继性 T 细胞疗法（ACT）中的意义在很大程度上仍不明确。在本研究中，北京大学口腔医学院（Peking University School and Hospital of Stomatology）等机构的研究人员利用由具有可调表面电荷强度的电活性纳米复合材料构成的带电底物，探究了电刺激对 CD8+ T 细胞的影响。电刺激增强了转移的 T 细胞的持久性和肿瘤抑制功效，且这些效应依赖于底物电荷。单细胞 RNA 测序分析显示，虚拟记忆 T（Tvm）细胞减少，增殖潜能 T（Tpp）细胞增加，与在不带电底物上处理的细胞相比，Tpp 细胞表现出更优异的抗肿瘤活性和代谢适应性。ATAC - seq 分析表明，对 Tpp 细胞分化至关重要的转录因子 EGR1 的上游结合位点的可及性增强。从机制上讲，带电底物破坏了离子型 TCR - 脂质相互作用，放大了 TCR 信号，并激活了 EGR1，从而在体外培养过程中阻碍了 Tvm 细胞的极化。这些研究结果凸显了细胞外电刺激在塑造 T 细胞命运方面的重要性，为优化 ACT 以用于治疗应用提供了潜力。

过继性细胞转移（ACT）已成为肿瘤学中一种有前景的治疗方法，能够精确靶向和消除癌细胞。然而，ACT 在实体瘤中的疗效常常受到 CD8+ T 细胞功能受损、激活不足以及肿瘤反应性 T 细胞寿命有限的影响。TCR - CD3 复合物介导肿瘤抗原的识别，启动对强大免疫反应至关重要的下游信号传导。然而，免疫抑制性肿瘤微环境会抑制 CD8+ T 细胞的激活和细胞毒性，从而促进肿瘤的免疫逃逸。与免疫检查点抑制剂不同，ACT 依赖于 T 细胞（包括嵌合抗原受体（CAR）T 细胞）的体外激活和扩增。越来越多的证据表明，这一阶段会影响肿瘤特异性 CD8+ T 细胞对癌症的治疗效果。因此，优化培养条件并阐明潜在机制对于扩大 ACT 免疫疗法的临床应用至关重要。

T 细胞的激活、增殖以及分化为效应 T 细胞和记忆 T 细胞，是由一系列外在和内在信号级联共同调控的，这对于对抗恶性肿瘤和建立持久的免疫保护至关重要。在 T 细胞受体（TCR）与抗原结合后，TCR 在细胞膜上形成簇，从而增强抗原识别。这会导致免疫突触的形成，进而激活一系列转录因子（TF），包括早期生长反应蛋白 1（EGR1）、活化 T 细胞核因子（NFAT）和激活蛋白 1（AP - 1），驱动对 T 细胞效应功能至关重要的基因转录。这些转录因子还调节染色质的可及性，从而塑造 T 细胞的功能并决定其命运。识别调节转录因子活性并指导 T 细胞分化的分子调节因子，对于增强 T 细胞介导的抗肿瘤反应至关重要。

在这些转录因子中，EGR1 在 CD8+ T 细胞反应中起着关键作用。在 T 细胞中，抗原受体交联或 TCR 刺激会迅速诱导 EGR1 的表达，它是连接早期 TCR 信号与下游基因表达的关键介质。研究已经证明了 EGR1 在各种 T 细胞过程中的重要性，包括胸腺发育以及对关键细胞因子（如 IL - 2 和 TNF）的调节，并且在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）模型中，它在病毒特异性 CD8+ T 细胞的克隆扩增中也起着至关重要的作用。利用压电膜材料，研究人员证明了电刺激在加速骨再生和抗菌方面的作用。在此基础上，本研究揭示了带电底物处理可增强 CD8+ T 细胞中 EGR1 的表达，并增加 EGR1 结合位点的染色质可及性，从而驱动细胞增殖和极化。重要的是，研究人员发现 EGR1 的激活是抗原依赖性的，这突出了其在不同免疫环境下塑造 CD8+ T 细胞反应中的作用。

在大多数临床环境中，自体 CD8+ T 细胞经过基因改造以表达转基因抗原受体，然后在体外进行短暂的激活和扩增，再重新注入患者体内。改善 T 细胞功能的努力通常集中在生物或化学干预上。虽然影响 T 细胞调节的生化因素已被广泛研究，但生物物理信号（如剪切应力、固体应力和基质刚度）在 CD8+ T 细胞激活中的关键作用也日益受到认可。这些物理特性可以独立或协同地影响肿瘤微环境和 CAR - T 细胞的疗效。此外，肿瘤微环境或炎症组织中 T 细胞的膜电位（MP）去极化已被证明会影响受体的移动性，并且在免疫突触处观察到了特征性振荡以及 TCR 信号调节中的静电相互作用。然而，电信号在 T 细胞内转化为生化信号的机制，以及外部电刺激是否可用于调节癌症治疗中的 T 细胞活性，仍然不清楚。

在本研究中，研究人员证明了体外培养过程中的外部电刺激可优化 CD8+ T 细胞的分化，增强 ACT 或 CAR - T 疗法在体内的疗效。通过增强 TCR 信号转导，电刺激减少了虚拟记忆 T 细胞的极化，并促进了具有更高增殖潜能的 CD8+ T 细胞的扩增，这些是 ACT 抗肿瘤效应的关键因素。研究结果突出了细胞外电刺激在塑造 CD8+ T 细胞命运方面的关键作用，为在癌症治疗中利用增殖潜能 T 细胞提供了基础策略。

研究结果

通过铁电纳米复合膜对 T 细胞反应进行电调制

细胞膜电位（MP）的变化与多种免疫细胞（如 B 细胞、巨噬细胞和中性粒细胞）的生理过程有关。然而，改变 MP 对 T 细胞生物学功能的影响仍不清楚。利用阴离子膜电位敏感荧光探针 DiBAC4 (3)，研究人员观察到 T 细胞激活过程中质膜 MP 的去极化（图 1a）。为了研究生物电信号对 T 细胞反应的影响，研究人员设计了一种底物电刺激平台，使用铁电纳米复合膜作为 T 细胞 MP 的调节剂（补充图 1a）。最初，通过将 BaTiO?纳米颗粒掺入聚（偏二氟乙烯 - 三氟乙烯）（P (VDF - TrFE)）基质中制备铁电纳米复合膜。通过调整退火和电晕极化参数，研究人员实现了对纳米复合膜电荷大小的可调调节，分别得到不带电（NC，55°C，未极化）、低带电（LC，55°C，极化）、中带电（MC，90°C，极化）和高带电（HC，120°C，极化）的纳米复合膜（补充图 1b - e）。使用开尔文探针力显微镜（KPFM）进行的表面电位测量显示，从 LC 组到 HC 组，电位分布均匀且显著增加（补充图 1b、c）。此外，剩余极化和压电系数（d??）随退火温度的升高而增加（补充图 1d、e）。进一步的表面结构分析证实，BaTiO?纳米颗粒在 P (VDF - TrFE) 基质中均匀分散（补充图 1f），且不同电荷参数的纳米复合膜之间表面粗糙度无显著差异（补充图 1g、h）。为了研究带电底物的电刺激是否会影响 T 细胞 MP，研究人员将 OT - I 细胞培养在纳米复合膜上，并用 OVA 肽激活 6 小时或用抗 CD3/CD28 抗体激活 24 小时。利用膜电压报告染料和全细胞膜片钳记录，研究人员观察到随着纳米复合膜表面电荷的增加，T 细胞膜去极化增强（图 1b - d 和补充图 2a）。重要的是，生物相容性评估表明，电活性纳米复合膜的细胞毒性极小（补充图 2b - d）。总之，研究人员制备了一系列具有不同表面电位的 BaTiO?/P (VDF - TrFE) 纳米复合膜，以研究细胞外电刺激对 T 细胞的影响，同时排除其他表面性质的干扰。

接下来，研究人员通过体外细胞毒性试验评估了 T 细胞的细胞溶解功能，发现与电刺激的 T 细胞共培养时，靶细胞活力显著降低（图 1e）。为了在体内证实这些发现，研究人员分离了未成熟的 OT - I 细胞，并将其培养在具有不同表面电荷的纳米复合膜上。在分别用 OVA 肽和 IL - 2 激活和诱导增殖后，将 OT - I 细胞过继转移到携带 LLC - OVA 肿瘤的小鼠体内（图 1f）。如图 1g、h 所示，由带电底物的电刺激诱导的 T 细胞表现出卓越的肿瘤控制能力，其疗效取决于电荷大小。此外，与空白组相比，NC 底物几乎不影响 T 细胞的细胞毒性功能（图 1g、h）。而且，从肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和引流淋巴结（dLN）中分离出的 CD8+ T 细胞数量和百分比呈剂量依赖性增加（图 1i - k 和补充图 3a）。此外，研究人员在输注后 24 小时检测了肿瘤浸润 T 细胞的状态，发现两组的浸润 T 细胞比例相当（补充图 3b）。然而，HC 组的 Ki - 67 表达显著更高（补充图 3c），这表明带电底物增强了 T 细胞的存活和增殖，有助于 T 细胞在后期更持久地存在，而不是在初始阶段增加浸润。

除了 T 细胞积累，研究人员还观察到肿瘤浸润的 OT - I 细胞中效应分子（如 TNF、IFNγ 和 GZMB）的表达增强（图 1l - n）。为了进一步阐明分子机制，研究人员应用 SMART - seq 检测了先前在铁电纳米复合膜上培养的肿瘤浸润 CD8+ T 淋巴细胞的状态（图 1o）。基因集富集分析显示，在 HC 纳米复合膜上培养的 T 细胞中，与 “效应 CD8 T 细胞” 和 “T 细胞受体信号通路” 相关的基因选择性富集（图 1p、q）。随后的流式细胞术分析也表明，HC 处理后肿瘤浸润 T 细胞上 CD247 和 CD28 的蛋白水平升高，这与转录组数据一致（补充图 3d、e）。研究人员还进行了富集分析，以检查 HC 组中上调基因的功能特征。如补充图 3f 所示，与 NC 组相比，HC 处理导致与 TCR 信号传导、T 细胞增殖和 IFNγ 产生相关的基因上调。相应地，在 HC 组显著上调的基因中，与 BioCarta 通路 “细胞毒性 T 细胞表面分子” 和 “细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）介导的对靶细胞的免疫反应” 相关的基因显著富集（补充图 3g）。上述发现表明，电刺激在体外和体内均增强了 T 细胞的抗肿瘤作用。
【此处插入图 1：带电底物的电刺激增强 T 细胞介导的抗肿瘤免疫。a. T 细胞膜电位的流式细胞术分析。分离 OT - I 细胞，用 OVA???????肽（2μg/mL）激活 6 小时，然后用 DiBAC4 (3) 染色（n = 5 个生物学重复，均值 ± 标准误，双侧未配对 Student's t 检验，****P < 0.0001）。b. 评估 T 细胞激活的研究设计示意图。分离 OT - I 细胞，在具有不同表面电荷的纳米复合膜上培养，并用 OVA???????肽（2μg/mL）激活 6 小时。NC，不带电纳米复合膜；LC，低带电纳米复合膜；MC，中带电纳米复合膜；HC，高带电纳米复合膜。c. T 细胞膜电位的流式细胞术分析。分离 OT - I 细胞，在具有不同表面电荷的纳米复合膜上培养，并用 OVA 肽（2μg/mL）处理 6 小时，然后用 DiBAC4 (3) 染色（n = 6 个生物学重复，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；# 与 MC 相比；***P = 0.0002，****P < 0.0001，&&&&P < 0.0001，####P < 0.0001，双侧未配对 Student's t 检验）。d. T 细胞膜电位的全细胞膜片钳记录。分离 OT - I 细胞，用 OVA???????肽（2μg/mL）激活 6 小时，然后进行电生理记录（n = 4 个生物学重复，均值 ± 标准误，**P = 0.0002，双侧未配对 Student's t 检验）。e. OT - I 转基因 T 细胞对表达 OVA 的 LLC 细胞的体外细胞毒性试验，效应细胞与靶细胞比例（E:T）逐渐降低。E，效应细胞；T，靶细胞（n = 4 个生物学重复，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；# 与 MC 相比；*P = 0.0169，&&P = 0.0047（E:T = 1:1），&&P = 0.0030（E:T = 0.5:1），****P < 0.0001，&&&&P = 0.0023，&&&&P < 0.0001，****P = 0.0006，****P < 0.0001，单因素方差分析）。f. 过继性 T 细胞治疗的示意图。简而言之，在第 0 天，将 LLC - OVA 细胞（2×10?）皮下接种到 NOD - SCID 小鼠体内。从 OT - I 小鼠的淋巴结和脾脏中分离出 OT - I 未成熟 T 细胞，在具有不同表面电荷的纳米复合膜上培养，用 OVA 肽（2μg/mL）激活 2 天，再用 IL - 2（10U/mL）扩增 4 天。在肿瘤接种后第 7 天，将 OT - I 细胞（3×10?）静脉注射到荷瘤小鼠体内。g. 静脉注射 OT - I 细胞的小鼠肿瘤的宏观评估（n = 6 只小鼠）。h. 随时间监测静脉注射 OT - I 细胞的小鼠的肿瘤体积（n = 6 只小鼠，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；ns，无显著性差异（P > 0.05），****P < 0.0001，&&&&P = 0.0002，####P < 0.0001，单因素方差分析）。i. 植入后 21 天静脉注射 OT - I 细胞的小鼠肿瘤浸润免疫细胞数量（n = 6 只小鼠，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；# 与 MC 相比；ns，无显著性差异（P > 0.05），*P = 0.0371，&&P = 0.0043，####P < 0.0001，&&&&P = 0.0050，°P = 0.0423，单因素方差分析）。j. 植入后 21 天静脉注射 OT - I 细胞的小鼠肿瘤中 CD8+ T 细胞频率的流式细胞术分析（n = 6 只小鼠，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；# 与 MC 相比；ns，无显著性差异（P > 0.05），*P = 0.0162，****P = 0.0004，####P < 0.0001，&&&&P < 0.0001，"P = 0.0019，单因素方差分析）。k. 植入后 21 天静脉注射 OT - I 细胞的小鼠引流淋巴结（dLN）中 CD8+ T 细胞频率的流式细胞术分析（n = 6 只小鼠，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；# 与 MC 相比；ns，无显著性差异（P > 0.05），P = 0.0447，###P = 0.0001，****P < 0.0001，&&&&P = 0.0001，°P = 0.0462，单因素方差分析）。l. 肿瘤浸润 OT - I 细胞中 TNF 表达的流式细胞术分析（n = 6 只小鼠，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；ns，无显著性差异（P > 0.05），*P = 0.0326，&&P = 0.0012，****P < 0.0001，&&P = 0.0126，单因素方差分析）。m. 肿瘤浸润 OT - I 细胞中 IFNγ 表达的流式细胞术分析（n = 6 只小鼠，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；ns，无显著性差异（P > 0.05），*P = 0.0299，&&P = 0.0365（MC 与 LC 相比），&&P = 0.0156（HC 与 LC 相比），单因素方差分析）。n. 肿瘤浸润 OT - I 细胞中 GZMB 表达的流式细胞术分析（n = 6 只小鼠，均值 ± 标准误，* 与 NC 相比；& 与 LC 相比；# 与 MC 相比；ns，无显著性差异（P > 0.05），****P < 0.0001，&&&&P < 0.0001，"P = 0.0090，单因素方差分析）。o. 研究肿瘤浸润 OT - I 细胞状态的研究设计示意图。简而言之，在第 0 天，将 LLC - OVA 细胞（2×10?）皮下接种到 NOD - SCID 小鼠体内。从 OT - I 小鼠的淋巴结和脾脏中分离出 OT - I 未成熟 T 细胞，在具有不同表面电荷的纳米复合膜上培养，用 OVA 肽（2μg/mL）激活 2 天，再用 IL - 2（10U/mL）扩增 4 天。在肿瘤接种后第 7 天，将 OT - I 细胞（3×10?）静脉注射到荷瘤小鼠体内。在第 21 天分离肿瘤浸润的 OT - I 细胞并进行 SMART 测序。p、q. 分离肿瘤浸润的 OT - I 细胞