印度旁遮普邦山羊胃肠道线虫的流行病学调查及驱虫药疗效评估

印度旁遮普邦的 Guru Angad Dev 兽医和动物科学大学（Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University）兽医寄生虫学系的研究人员 Amanpreet Kaur、Nirmaljeet Kaur、Karishma Chauhan 等，在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Epidemiology of caprine gastrointestinal nematodes and associated efficacy of anthelmintic drugs in Punjab districts, India” 的论文。这篇论文对于深入了解印度旁遮普邦山羊胃肠道寄生虫（Gastrointestinal Parasites，GIP）感染情况，以及评估驱虫药在该地区的疗效具有重要意义，为制定更有效的寄生虫防控策略提供了关键依据，也为全球小型反刍动物养殖中寄生虫病的防治提供了有价值的参考。

一、研究背景

小型反刍动物养殖在提升印度无地和边际农民经济地位方面发挥着重要作用，其中山羊数量在印度家畜总数中占比约 27.8%。然而，多种病原体严重影响着山羊养殖的可持续性和盈利能力，胃肠道线虫（Gastrointestinal Nematodes，GIN）尤其是捻转血矛线虫（Haemonchus contortus），作为最具致病性的蠕虫，给养殖户带来了巨大经济损失，印度每年用于治疗的费用约为 1.03 亿美元。

GIN 感染在热带和亚热带地区，包括印度旁遮普邦极为普遍。这主要是因为当地全年大部分时间的环境条件都有利于线虫自由生活阶段的发育和繁殖。严重感染 GIN 会导致山羊生长缓慢、体重增加减少、饲料效率降低、受孕率下降、其他传染病发病率上升、奶 / 肉产量降低、肉类检验时胴体或器官被拒收、兽医护理成本增加，甚至羊群发病率和死亡率上升。

目前，山羊线虫感染的管理和控制主要依赖化学驱虫药进行化疗，这也是养殖户最常用的方法。但长期大量使用（特别是单一药物）、用药剂量不足以及在无兽医指导下自行驱虫等因素，导致山羊对 GIN 产生驱虫药抗性。此外，由于新药研发成本高且抗性出现迅速，新型有效驱虫药的商业供应也受到限制。驱虫药抗性对小型反刍动物的可持续生产构成严重威胁，因此，持续监测 GIN 对驱虫药的抗性状态，对制定合理的控制措施、限制抗性传播以及合理使用驱虫药至关重要。

已有研究表明，全球多个地区，包括印度，都有小型反刍动物对 GIN 产生驱虫药抗性（单一或多种）的报道。目前已开发出多种体内和体外检测方法来评估药物疗效和检测抗性，其中最常用的有粪便虫卵计数减少试验（Faecal Egg Count Reduction Test，FECRT）、虫卵孵化试验（Egg Hatch Test，EHT）和幼虫发育试验（Larval Development Assay，LDA）。在印度旁遮普邦，农民主要使用苯并咪唑类、咪唑噻唑类和大环内酯类药物来防治山羊 GIN 感染，但这些药物的滥用导致疗效下降，且该邦部分地区对这些药物产生抗性的报道有限且零散。

深入了解疾病的流行病学模式和各种风险因素对疾病分布的影响，对于设计可持续且有效的山羊胃肠道寄生虫控制策略至关重要。同时，由于驱虫药抗性的发展以及新药研发的困难，有必要全面了解药物抗性状况，以优化药物使用。因此，本研究旨在调查印度旁遮普邦不同农业气候区山羊胃肠道寄生虫的流行病学情况以及驱虫药抗性状况。

二、研究方法

（一）研究区域

旁遮普邦位于印度西北部，地理面积 50,362 平方公里，海拔在 180 - 300 米之间，气候类型包括暖半干旱（BSh）和湿润亚热带（Cfa）。该邦根据土壤类型、地下水位、地下水水质、降雨量等因素分为三个农业气候区：I 区（亚山区，含五个区）、II 区（中部平原区，含十二个区）、III 区（西南区，含六个区）。当地山羊养殖主要采用半集约化管理系统，山羊在牧场放牧，同时在畜舍补充精饲料并自由饮水。

（二）抽样方法和样本量

研究选取印度旁遮普邦 17 个区半集约化管理系统下的本地品种山羊进行流行病学调查。纳入所有性别和年龄段的山羊，通过牙齿情况或主人报告确定年龄，并记录过去 3 个月的驱虫史及使用的驱虫药。该地区常用含阿苯达唑、芬苯达唑（Fenbendazole，FBZ）、左旋咪唑（Levamisole，LEV）、伊维菌素（Ivermectin，IVM）、奥西氯嗪及其组合的驱虫药。采用重复横断面研究设计，在夏季、季风季和冬季进行抽样，按照简单随机抽样技术，为确保能对山羊 GIP 感染流行率得出可靠结论，决定覆盖该邦至少 0.5% 的山羊种群。

为评估常用药物类别（苯并咪唑类、咪唑噻唑类和大环内酯类）的驱虫药抗性状况，在旁遮普邦 17 个选定农场进行体内（FECRT）和体外（EHT 和 LDA）试验。选择农场的标准是半集约化养殖系统且羊群规模至少 50 只。向农场主说明研究目的，确保研究期间不进行自我用药并保留试验动物。山羊的主要饲料来源是放牧时的草料和畜舍内的精饲料。同时，遵循世界兽医寄生虫学促进会（World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology，WAAVP）关于驱虫药疗效和抗性评估的指南，选择过去 12 周内未接受任何驱虫药且粪便虫卵数（EPG）≥150 的山羊。

（三）样本采集

在 2023 年 6 月至 2024 年 9 月期间，从每只山羊直肠直接采集 5 - 10 克粪便样本，共采集 1962 份。采集后将样本置于清洁、标记好的样本收集管中，用保温冰盒在冷却条件下运输至兽医寄生虫学系研究生实验室进行检测。由于要对样本进行粪便培养，所以未添加化学防腐剂，样本储存于 4°C 直至处理。

（四）粪便检查

对采集的粪便样本先进行定性检查，即通过简单的粪便沉淀和饱和盐水漂浮法，根据寄生虫虫卵、卵囊或包囊的形态特征和特点识别肠道寄生虫阶段。对于寄生虫线虫卵阳性样本，采用麦克马斯特虫卵计数技术进行定量分析，估算每克粪便中的虫卵数（EPG），并将感染程度分为低（EPG <800）、中（EPG 800 - 1200）、高（EPG> 1200）三个等级。为确定 GIN 的属，对阳性样本进行标准粪便培养，然后用贝尔曼技术收集第三期幼虫（）。将置于载玻片上，用卢戈氏碘液（HiMedia，印度）杀死，根据其前后端形状、肠细胞数量、食道长度和头部折射等形态特征进行属的鉴定。

（五）粪便虫卵计数减少试验

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用于疗效测试的药物包括 2.5% 的芬苯达唑悬浮液（MSD，印度），剂量为 10.0 毫克 / 千克体重；150 毫克的左旋咪唑片剂（KLAB，北阿坎德邦，印度），剂量为 12.0 毫克 / 千克体重；0.08% 的伊维菌素口服溶液（Virbac，印度），剂量为 0.4 毫克 / 千克体重。选择这些驱虫药是因为它们在山羊养殖户中使用广泛。进行 FECRT 时，先估算动物体重，然后随机将其分为四组（FBZ 组、LEV 组、IVM 组和对照组），每组 10 ± 1 只山羊，通过在羊颈部系不同颜色尼龙绳对每组进行编码。根据动物体重给相应组的山羊投喂驱虫药，对照组不进行处理。在给药前（D0）和给药后第 14 天（D14）从每只动物直肠采集粪便样本，估算个体 EPG，以确定粪便虫卵计数减少百分比（FECR%）。此外，为研究治疗对单个 GIN 属的影响，对 D14 时每组处理组和对照组收集的混合粪便样本进行培养，用贝尔曼技术回收并进行鉴定。

（六）虫卵孵化试验

在 FECRT 期间采集的 D0 粪便样本上进行 EHT，以检测苯并咪唑类药物抗性。从混合粪便样本中分离虫卵，将新鲜虫卵悬浮液加入 48 孔培养板（VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺），每孔约含 150 - 200 个虫卵，加入适量蒸馏水使最终体积达到 190 微升。用 2 毫升二甲基亚砜（DMSO，SRL，印度）溶解 2 毫克噻苯达唑（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）制备 1 毫克 / 毫升的储备液（溶液 A）。取 80 微升溶液 A，加入 920 微升 2% DMSO 制备 80 微克 / 毫升的溶液 B。在处理孔中加入 10 微升浓度为 0.06、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 和 4.0 微克 / 毫升的溶液 B，在对照孔中加入 2% DMSO，每个样本进行三次重复试验。将培养板密封后在 28°C 的生化培养箱中孵育 48 小时，之后向每孔加入一滴卢戈氏碘液，在复合显微镜（CX - 21 Olympus，日本）下计数至少 100 个（死卵、胚胎卵）虫卵和孵化的幼虫。

（七）幼虫发育试验

在 FECRT 期间采集的 D0 粪便样本上进行 LDA，以检测对 LEV 和 IVM 的抗性。从混合粪便样本中分离虫卵，将约含 150 - 200 个虫卵的新鲜悬浮液转移到 48 孔培养板（VWR，美国）的每孔中，加入适量蒸馏水使体积达到 440 微升。然后向每孔加入 50 微升 LDA 培养基和 10 微升两性霉素 B（Sigma-Aldrich，美国）。将培养板在 28°C 的生化培养箱中孵育 24 小时，检查幼虫的存在情况。用 1 毫升 DMSO 分别溶解 1 毫克左旋咪唑（Sigma-Aldrich，美国）和 1 毫克伊维菌素（Sigma-Aldrich，美国）制备 1 毫克 / 毫升的储备液（溶液 A）。取 320 微升溶液 A，加入 1680 微升 2% DMSO 制备 160 微克 / 毫升的溶液 B（用于 LEV 和 IVM）。在处理孔中加入 500 微升浓度为 0.31、1.25、5.0、20.0 和 80.0 微克 / 毫升的溶液 B，在对照孔中加入 2% DMSO。密封培养板后在 28°C 的生化培养箱中孵育 6 - 7 天，促进第三期幼虫发育。之后向每孔加入一滴卢戈氏碘液，将每孔悬浮液转移到 1.5 毫升微量离心管中，在 MiniSpin Plus（Eppendorf，德国）离心机中以 3000 转 / 分钟离心 4 分钟，弃去上清液，将约 200 微升沉淀物轻轻混合后转移到无油脂的载玻片上，在复合显微镜下计数每孔未孵化的虫卵、孵化出的第一期、第二期和第三期幼虫数量。

（八）数据分析

使用 IBM SPSS Statistics 20 软件对流行病学数据进行分析。采用逻辑回归和卡方检验评估风险因素与胃肠道寄生虫感染流行率之间的关联，通过优势比和 95% 置信区间下的 p 值确定这些关联的强度和显著性。对于 FECRT，使用开源软件（www.fecrt.com）计算治疗前后粪便线虫卵排出量的算术平均值和 90% 置信区间，以确定对驱虫药的抗性状态。通过概率单位分析（Probit analysis）使用 Polo - Plus 软件估计 EHT 和 LDA 中抑制虫卵孵化和幼虫发育 50% 的有效浓度（）及其 95% 置信区间。在 EHT 试验中，噻苯达唑值 > 0.1 微克 / 毫升的分离株被认定为抗性。在 LDA 中，通过田间分离株的与敏感分离株的的商来确定选定农场对 LEV 和 IVM 的抗性比（RR）。本研究中，LEV 敏感分离株的值（0.36 μM 或 0.087 微克 / 毫升，根据 Ruffell 等人的研究）用于 RR 的估算，IVM 的 RR 则通过 FECRT 确定为敏感的 ASR 分离株的值进行估算。此外，为比较体内和体外驱虫药抗性检测方法，估算 FECRT 药物疗效（%）与 EHT/LDA 中每种驱虫药的值（微克 / 毫升）之间的线性关系强度，并确定相关系数（r）。

三、研究结果

（一）山羊胃肠道寄生虫的流行情况：定性和定量分析

对来自印度旁遮普邦的 1962 份山羊粪便样本进行定性粪便检查，发现 1837 份样本 GIP 呈阳性，总体流行率为 93.62%，其中 70.85%（）的动物存在多种寄生虫混合感染。圆线虫（Strongyles）最为常见（；88.99%），其次是球虫（Coccidia，；65.34%）、莫尼茨绦虫属（Moniezia spp.，；16.62%）、毛首线虫属（Trichuris spp.，；9.38%）、类圆线虫属（Strongyloides spp.，；7.65%），而吸虫（Fasciola spp. 和双口吸虫属 Amphistomes，；0.02%）最为罕见。

对圆线虫阳性动物进行定量检查，发现每克粪便中的虫卵数（EPG，平均值 ± 标准误差）为 1446.79 ± 49.78，其中 48.05%（）、14.43%（）和 37.51%（）的山羊分别处于低、中、高感染水平。此外，季风季节的 EPG 最高（1830 ± 89.97），其次是夏季（1515.78 ± 94.30）和冬季（844.42 ± 50.81）。

通过贝尔曼技术从全年所有流行病学样本的粪便培养物中分离出的第三期幼虫（）鉴定出六种 GIN 属，其中血矛线虫属（Haemonchus）占主导（75.94%），其次是毛圆线虫属（Trichostrongylus，16.44%）、食道口线虫属（Oesophagostomum，4.85%）、仰口线虫属（Bunostomum，1.65%）、奥斯特线虫属（Ostertagia，0.77%）和古柏线虫属（Cooperia，0.33%）。

（二）与胃肠道寄生虫相关的风险因素评估

流行病学数据的统计分析表明，除毛首线虫属外，所有报告的 GIP 流行率均与季节显著相关（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"），夏季感染率最高，而球虫在季风季节感染率更高。在农业气候区方面，圆线虫（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"，II 区最高）、类圆线虫属（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"，I 区最高）、莫尼茨绦虫属（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"，I 区最高）、片形吸虫属和双口吸虫属（，I 区最高）的流行率存在显著差异。山羊的驱虫情况与圆线虫、莫尼茨绦虫属、双口吸虫属和片形吸虫属感染的流行率显著相关（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"，），过去 3 个月内驱虫的动物阳性率较低。

宿主年龄与圆线虫（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"，>1 岁年龄组最高）、毛首线虫属（，>1 岁年龄组最高）、莫尼茨绦虫属（，<6 月龄年龄组最高）和类圆线虫属（，6 月龄 - 1 岁年龄组最高）的流行率显著相关。动物性别与圆线虫感染显著相关（），雌性感染率高于雄性。

逻辑回归分析显示，农业气候区、季节、性别和驱虫状态等风险因素与旁遮普邦山羊 GIP 的流行率显著相关。位于农业气候区 III（西南区）的动物比其他两个区受影响更大（；）；夏季感染率高于季风和冬季（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"，）；雌性感染率更高（，）；过去 3 个月未驱虫的动物感染率更高（span data-custom-copy-text="\(p 0.001\)"，）。