抑制CXCR4可降低骨髓细胞在乳腺癌免疫治疗中的免疫抑制作用

　　

靶向 CXCR4 联合免疫治疗三阴性乳腺癌的研究进展

美国密歇根大学放射学系分子成像中心的 Nicholas G. Ciavattone 等研究人员在Scientific Reports期刊上发表了题为 “Inhibiting CXCR4 reduces immunosuppressive effects of myeloid cells in breast cancer immunotherapy” 的论文。该研究聚焦三阴性乳腺癌（TNBC）免疫治疗难题，发现抑制趋化因子受体 4（CXCR4）联合抗程序性死亡受体 1（anti-PD-1）治疗可显著提升 TNBC 免疫治疗效果，为 TNBC 免疫治疗开辟了新方向，有望改善患者预后，推动 TNBC 临床治疗的发展。

一、研究背景

TNBC 是一种侵袭性强、预后差的乳腺癌亚型。近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现为 TNBC 治疗带来了新希望，但整体受益患者比例较低，仅约 8 - 20% 的患者对当前免疫治疗方案有反应 。多数 TNBC 患者无法从免疫治疗中获益，且面临免疫检查点抑制剂引发的自身免疫性并发症风险。因此，探寻提高 TNBC 免疫治疗疗效的方法迫在眉睫。

趋化因子 CXCL12 及其受体 CXCR4 在 TNBC 肿瘤免疫微环境中发挥着关键作用。一方面，癌细胞通过 CXCL12 - CXCR4 信号通路促进肿瘤生长、侵袭和转移。另一方面，该信号通路调控免疫细胞的募集与功能。肿瘤细胞分泌的 CXCL12 可结合 T 细胞表面的 CXCR4，抑制 T 细胞的运动和趋化，阻止其进入肿瘤内部，形成免疫排斥环境，降低免疫治疗效果。同时，CXCL12 - CXCR4 还招募髓源性抑制细胞（MDSCs）、调节性 T 细胞（Tregs）等免疫抑制细胞，抑制抗肿瘤免疫反应，与 TNBC 不良预后相关 。MDSCs 能分泌精氨酸酶 1、白细胞介素 10（IL - 10）和转化生长因子 β（TGF - β）等抑制性分子，抑制 T 细胞和自然杀伤细胞（NK 细胞）功能。阻断 MDSCs 的作用在 TNBC 临床前模型中可产生良好免疫反应并消除肿瘤。在胰腺癌、肝癌和转移性乳腺癌的临床前模型中，抑制 CXCR4 可克服 CXCL12 - CXCR4 信号通路的免疫抑制作用，但具体机制尚未完全明确。

二、研究材料与方法

（一）细胞系

选用小鼠 E0771 乳腺癌细胞和 C57BL/6J 小鼠乳腺成纤维细胞进行培养，培养基为添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% GlutaMax、1% 青霉素 - 链霉素和 1% plasmocin 的 DMEM 基础培养基，细胞在 37°C、5% CO?的湿润培养箱中培养。用于分析 CXCR4 抑制剂的细胞实验采用稳定转导 CXCR4 和激酶转位报告基因（KTRs）的 MDA - MB - 231 细胞，培养条件与上述相同，并通过 STR 分析对细胞系进行鉴定。

（二）细胞实验

在 96 孔玻璃底板中接种 MDA - MB - 231 KTR 细胞，培养 1 天后更换为含 1% 血清的 Fluorobrite 培养基，孵育 1 小时后加入 AMD3100 或 balixafortide，30 分钟后用 EVOS M7000 成像系统在特定条件下对 KTRs 进行成像。在检测 CXCL12 刺激的实验中，按上述步骤处理细胞并添加抑制剂，获取 10 分钟图像后加入 100 ng/ml CXCL12 - α，继续采集 40 分钟图像，利用内部 Matlab 脚本对单细胞数据进行量化分析。

（三）小鼠肿瘤模型

经密歇根大学实验动物使用与管理委员会（IACUC）批准，将 5×10?个 E0771 小鼠乳腺肿瘤细胞和 1×10?个小鼠乳腺成纤维细胞原位植入 6 - 8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠的第 4 腹股沟乳腺脂肪垫。细胞植入 2 天后，将小鼠随机分为 4 组（每组 n = 10），分别接受 balixafortide（20 mg/kg，皮下注射，每日 1 次）联合 anti - PD - 1 抗体（5 mg/kg，腹腔注射）、balixafortide、anti - PD - 1 抗体或对照处理。定期用卡尺测量肿瘤大小，当肿瘤达到预定人道终点时，对小鼠实施安乐死。

（四）免疫组织化学

实验终点时，取出肿瘤用 10% 福尔马林固定，制备石蜡切片，用抗 B220 抗体对 B 细胞进行免疫染色，使用 Aperio Imagescope 软件标注 B220 阳性细胞密集区域并测量其像素面积。

（五）单细胞测序分析

用 gentleMACS Octo 解离器消化肿瘤组织，经滤网过滤后富集 CD45?细胞，按 7:3 比例与 CD45?细胞混合。对不同处理组的肿瘤细胞进行 Dropseq 高通量单细胞条形码转录组建库测序，在 Seurat 中对数据进行处理，筛选出 UMI＞200 且线粒体含量低于 5% 的活细胞，利用 R 语言中的相关工具进行数据分析。

（六）T 细胞抑制实验

从野生型 C57BL/6J 小鼠脾脏中分离 T 细胞，去除调节性 T 细胞后用 Cell Trace Far Red 标记。用抗 CD3ε 和抗 CD28 抗体包被 96 孔板，添加人 IL - 2 激活 T 细胞。将不同处理组的肿瘤髓细胞与 T 细胞按不同比例共培养，通过流式细胞术检测 T 细胞增殖情况。

（七）统计学分析

使用 Prism GraphPad V9 软件进行数据处理，对正态分布样本采用 t 检验，非参数样本采用 Mann - Whitney 检验。生存分析使用 Kaplan - Meier 曲线和 Mantel - Cox 检验、Mantel - Haenszal 检验，评估体内肿瘤负荷差异和抑制实验采用方差分析（ANOVA）。

三、研究结果

（一）Balixafortide 作为 CXCR4 的反向激动剂

利用 KTR 细胞，研究人员对比了 balixafortide 和临床批准的 CXCR4 抑制剂 AMD3100 对 Akt 和 ERK 激酶活性的影响。在无 CXCL12 刺激的稳态条件下，1 μM AMD3100 处理 30 分钟后，Akt 和 ERK 活性与对照组无显著差异；而 10 nM 或 100 nM balixafortide 处理则显著降低 Akt 和 ERK 的稳态水平。在 CXCL12 刺激实验中，AMD3100 可完全阻断 CXCL12 依赖的 Akt 和 ERK 激活，10 nM balixafortide 对 Akt 激活的倍数变化影响较小，100 nM balixafortide 则适度降低 CXCL12 - CXCR4 信号对 Akt 的激活。这些结果表明 balixafortide 作为 CXCR4 的反向激动剂，对 CXCL12 - CXCR4 信号具有浓度依赖性抑制作用。

（二）Balixafortide 联合 anti - PD - 1 改善肿瘤生长和生存

将 E0771 细胞原位植入小鼠后进行分组治疗，结果显示，balixafortide 或 anti - PD - 1 单药治疗与对照组相比，仅适度抑制肿瘤生长；而 balixafortide 联合 anti - PD - 1 治疗在肿瘤生长后期显著降低肿瘤体积（p < 0.01）。生存分析表明，联合治疗组小鼠的死亡风险比显著低于其他组（p < 0.05），相对联合治疗组，其他组死亡风险高约 2.5 倍或更高。这表明 balixafortide 联合 anti - PD - 1 免疫治疗相较于单药治疗，能更有效地抑制肿瘤生长、延长小鼠生存期。

（三）Balixafortide 增加三级淋巴结构（TLS）的形成

通过对肿瘤切片进行 B 细胞染色评估 TLS 形成情况，对照组肿瘤几乎不形成 TLS，anti - PD - 1 单药治疗仅在少数切片中形成少量、无序的 TLS。而 balixafortide 单药或联合 anti - PD - 1 治疗的肿瘤中，可观察到大量、有组织的 TLS，且 B 细胞滤泡密集。量化分析显示，balixafortide 治疗组 TLS 平均面积最大，虽与联合治疗组无显著差异，但显著大于 anti - PD - 1 单药或对照组（p < 0.05）。这说明 balixafortide 可调节肿瘤局部免疫环境，促进 TLS 形成，而 TLS 的增加与免疫治疗成功相关。

（四）转录组分析揭示肿瘤微环境的变化

对不同处理组小鼠肿瘤免疫细胞进行单细胞 RNA 测序分析，主成分分析识别出 13 个不同的 Louvain 簇，包括多种髓细胞类型、T 细胞群体、B 细胞、NK 细胞和树突状细胞等。CXCR4 主要在大髓细胞簇、记忆 CD8 T 细胞和 B 细胞中表达，Pdcd1（PD - 1 蛋白）在活化的记忆 CD8 + T 细胞簇中特异性表达。通路分析发现，balixafortide 或联合治疗组中趋化因子信号通路表达得分降低，尤其是在髓细胞和 B 细胞群体中，表明 balixafortide 在体内成功靶向 CXCR4。此外，balixafortide 单药治疗还影响髓细胞免疫相关的其他通路，如在巨噬细胞和单核细胞中，STAT 信号通路得分负向移动。

（五）Balixafortide 和 anti - PD - 1 调节免疫细胞功能

在 T 细胞功能相关基因分析中，联合治疗显著降低幼稚 CD8 + T 细胞簇中 Il7r 和 CCR7 的表达，减少肿瘤中幼稚旁观者细胞数量；在活化的记忆 CD8 + T 细胞簇中，联合治疗降低了 Pdcd1、Ctla4、Havrc2、Lag3、Tox 和 CD200 等 T 细胞耗竭标记基因的表达，同时增加了 CD39 的表达，且联合治疗组中细胞毒性效应分子 Prf1 和 Gzmb 的表达高于对照组和 anti - PD - 1 单药治疗组，表明联合治疗可增强 CD8 + T 细胞的细胞毒性。对于肿瘤内 B 细胞，联合治疗促进其增殖，Mki67 表达升高，且 CR2（CD21）表达增加，与 TLS 诱导相关。在髓细胞方面，balixafortide 单药或联合治疗降低了单核细胞中 CCL2、CCL3 和 Il1b 等抑制抗肿瘤免疫基因的表达，在巨噬细胞中，联合治疗降低了 MIF 的表达，同时所有治疗组均提高了抗原呈递基因 H2 - Aa 和 H2 - Ab1 的表达。

（六）Balixafortide 和 anti - PD - 1 减少髓细胞介导的免疫抑制

通过肿瘤抑制实验评估不同处理组肿瘤髓细胞对 T 细胞增殖的影响，在髓细胞与幼稚 T 细胞比例为 10:1 时，对照组和 anti - PD - 1 组髓细胞分别将 T 细胞增殖抑制至约 30% 和 20%，balixafortide 单药治疗组抑制至约 60%，而联合治疗组中 50% 的 T 细胞发生增殖，比无髓细胞的基线对照组高 10%。这表明 balixafortide 单药可挽救免疫抑制髓细胞存在下的 T 细胞增殖，与 anti - PD - 1 联合使用时效果更显著。

四、研究结论与讨论

研究表明，在 TNBC 小鼠模型中，联合 anti - PD - 1 和 CXCR4 抑制剂 balixafortide 可显著改善免疫治疗效果。联合治疗通过多种互补机制，将肿瘤免疫环境转变为更有效的抗肿瘤状态，包括增加 TLS 数量、降低 T 细胞耗竭相关基因表达、提高效应 T 细胞活性标记物水平，以及减少肿瘤中免疫抑制性髓细胞的特征。体外实验进一步验证，联合治疗后分离的 MDSCs 对 T 细胞增殖的抑制作用明显减弱。这些结果支持将抑制 CXCR4 作为增强 TNBC 免疫治疗效果的潜在策略，为未来开展相关临床试验提供了有力依据。

此前研究已证实抑制 CXCR4 可改善多种恶性肿瘤的免疫治疗效果。在转移性 TNBC 小鼠模型中，阻断 CXCR4 可减少转移灶纤维化，改善血管灌注，促进 T 细胞向肿瘤核心浸润；在肝癌小鼠模型中，阻断 CXCL12 - CXCR4 信号可逆转多激酶抑制剂索拉非尼的免疫抑制作用；在胰腺癌和结直肠癌的 I 期临床研究中，抑制 CXCR4 联合 anti - PD - 1 治疗可减少免疫抑制，增加肿瘤浸润的细胞毒性 T 细胞和 NK 细胞数量 。本研究将这些发现扩展到局部 TNBC 的治疗中。

与以往研究中使用的 CXCR4 抑制剂 AMD3100 不同，balixafortide 是一种合成环肽，作为 CXCR4 的反向激动剂，可降低效应激酶 Akt 和 ERK 的稳态信号。Balixafortide 联合化疗药物艾瑞布林虽未改善转移性 TNBC 患者的缓解率，但具有可接受的安全性，为开展改善 anti - PD - 1 免疫治疗的临床试验提供了可能。

Balixafortide 单独或与 anti - PD - 1 联合使用可增加原位乳腺肿瘤中 TLS 的数量。TLS 在肿瘤免疫反应中发挥重要作用，高数量的 TLS 与 TNBC 和其他恶性肿瘤的良好预后及免疫治疗反应相关。研究推测，balixafortide 可能通过阻断 CXCL12 - CXCR4 信号，防止肿瘤免疫关键效应细胞被排除在肿瘤环境之外，从而促进 TLS 形成，增强免疫治疗反应。

此外，研究还发现 anti - PD - 1 联合 balixafortide 对抑制性髓细胞功能有显著影响。MDSCs 在癌症进展中大量扩增并被招募到肿瘤部位，抑制其招募和功能可增强免疫治疗效果。联合治疗对 MDSCs 的抑制作用在体外实验中仍能持续，表明 balixafortide 对 MDSCs 功能的抑制作用在一定时间内具有持续性，但具体机制有待进一步研究。

本研究也存在一定局限性。研究主要集中在 balixafortide 对肿瘤免疫环境的影响，虽已知抑制 CXCL12 - CXCR4 可直接阻断癌细胞的生长和转移相关功能，但未深入探究其对癌细胞的具体作用。实验使用的是对免疫治疗有反应的单一小鼠 TNBC 细胞系，未来需在无反应的乳腺癌模型中进一步研究抑制 CXCR4 联合 anti - PD - 1 治疗的效果。

综上所述，该研究揭示了 CXCR4 在 TNBC 免疫抑制肿瘤环境中的关键作用，为 TNBC 免疫治疗提供了新的联合治疗策略。未来临床试验有望验证该策略在患者中的有效性，为 TNBC 患者带来更好的治疗前景。