胰岛素信号通路的阶段性传播机制：时间分辨磷酸化蛋白质组学的新发现

细胞内胰岛素信号的时间调控尚未得到很好的研究。在这里，作者对人类肌肉细胞中胰岛素调节的磷酸化蛋白组进行了时间分辨分析，揭示了将信息传播到胰岛素效应位点的同步信号通路。

　　

在胰岛素信号传导的研究领域，德国糖尿病中心（German Diabetes Center, DDZ）等多单位的研究人员取得了重要进展。由 Michael Turewicz、Christine Skagen 等众多研究者合作完成的论文 “Temporal phosphoproteomics reveals circuitry of phased propagation in insulin signaling” 发表于《Nature Communications》杂志。这一研究通过时间分辨的磷酸化蛋白质组学分析，深入揭示了胰岛素信号通路的动态变化和阶段性传播机制，为理解胰岛素作用机制、糖尿病发病机理以及开发潜在治疗靶点提供了关键线索，在代谢疾病研究领域具有重要意义。

一、研究背景

胰岛素作为一种多效性激素，在调节能量代谢、细胞分化、生存和生长等方面发挥着关键作用。它通过激活胰岛素受体，引发复杂的细胞内信号级联反应，其中蛋白质磷酸化是关键环节 。在骨骼肌中，胰岛素作用受损与 2 型糖尿病的发生发展密切相关，但胰岛素调节的细胞信号通路及其在疾病病因学中的作用尚未完全明确。此前的研究虽已鉴定出许多胰岛素调节的磷酸化位点，但存在局限性：多数研究为单点分析，未考虑胰岛素信号的时间动态变化；缺乏对保留供体固有特征的人原代肌管中时间依赖性胰岛素信号的研究；且以往研究较少关注不同供体来源的分化人骨骼肌细胞中胰岛素信号的个体差异 。

二、研究材料与方法

（一）细胞培养与处理

研究人员从 5 名健康男性供体的股外侧肌活检组织中分离卫星细胞，将其培养为肌管。在分化第 6 天，对肌管用 100 nM 胰岛素刺激不同时间（0、1、2.5、5、15、30 和 60 分钟），同时设置无胰岛素刺激的对照组。刺激结束后，收集细胞用于后续分析。

（二）蛋白质组学分析

采用 FASP 方法对细胞裂解液进行蛋白酶消化，利用 TiO?/Fe2?IMAC 富集磷酸化肽段，进行液相色谱 - 质谱（LC - MS）分析。同时，对细胞裂解液进行定量蛋白质组学分析，以校正总蛋白丰度的潜在差异。通过 Proteome Discoverer 软件分析质谱原始数据，鉴定和定量磷酸化肽段和蛋白质。

（三）RNA 测序

从胰岛素刺激和未刺激的细胞中提取 RNA，进行核糖体去除、片段化、cDNA 合成、接头连接和文库扩增等操作，构建文库后在 NextSeq 2000 系统上进行测序。利用多种生物信息学工具和 R 语言自定义数据分析流程对测序数据进行分析。

（四）生物信息学分析

运用主成分分析（PCA）研究不同供体对胰岛素的个体反应；通过计算 Pearson 相关系数评估磷酸化位点的供体间变异性；采用激酶 - 底物过表达分析（KSORA）研究激酶激活的时间模式；利用网络传播算法构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络，识别关键信号模块和子网；进行 Reactome 通路富集分析，探究不同时间点胰岛素信号通路的变化。

三、研究结果

（一）定量分析胰岛素刺激的分化人骨骼肌细胞磷酸化蛋白质组

研究人员对胰岛素刺激的分化人骨骼肌细胞进行了全面的磷酸化蛋白质组分析。在所有供体和时间点，技术重复间磷酸化肽段丰度的变异较低（中位 Pearson 相关系数 r = 0.98）。研究共定量了 20,470 个肽段，其中包括 13,196 个磷酸化肽段，对应 11,572 个 I 类磷酸化位点，映射到 4415 个磷酸化蛋白质，且绝大多数（>99%）磷酸化发生在丝氨酸 / 苏氨酸残基上。胰岛素刺激 60 分钟对总细胞裂解物中的蛋白质丰度影响较小，仅有 10 种蛋白质显著差异。通过将单个磷酸化位点丰度归一化到相应的肽段 / 蛋白质丰度，证实了磷酸化肽段丰度的变化源于磷酸化事件而非蛋白质丰度的改变。在胰岛素刺激下，不同时间点有不同数量的磷酸化肽段发生显著差异磷酸化，整个时间过程中共有 2741 个独特的磷酸化肽段在至少一个时间点出现差异磷酸化，约占分析的所有磷酸化肽段的 21% 。

（二）胰岛素调节的磷酸化肽段的供体和时间依赖性聚类

研究人员对具有连续定量信息的 11,612 个磷酸化肽段进行 PCA 分析。当考虑所有定量的磷酸化肽段时，来自个体供体的样本相似度最高，大多与胰岛素处理时间无关；而对最显著受胰岛素调节的磷酸化肽段（p<0.01 且 FC>3 或 < 1/3 vs. t?）进行 PCA 分析时，发现了明显的聚类现象，这些聚类反映了胰岛素信号传导中的早期、中期和晚期磷酸化事件 。不同聚类中显著调节的胰岛素靶标的重叠情况表明，每个聚类都有相当一部分独特的磷酸化肽段，同时也有 > 400 个胰岛素刺激位点在整个时间过程中持续磷酸化。

（三）人骨骼肌细胞中经典胰岛素信号通路的靶点

研究人员剖析了经典胰岛素信号通路中关键靶点的磷酸化时间进程，如 AKT 的底物 p70 核糖体 S6 激酶（p70S6K/RPS6KA/B）和 p90 核糖体 S6 激酶（p90RSK/RPS6KB）。胰岛素刺激导致 AKT2 的调节位点 T309 和 S474 迅速磷酸化，5 分钟时达到最大磷酸化水平。不同 AKT 底物的磷酸化动力学有所不同，部分底物如 AKT1S1（T246）、FOXO3（S253）等磷酸化较快，而 ACLY（S455）、PDCD4（S76）等则延迟磷酸化 。此外，MAPK1（T185）的磷酸化在 5 分钟达到峰值，早于 MAPK3（T202）和 RPS6KA3（S369）。胰岛素刺激还导致酪氨酸磷酸酶 PTPN112 的主要激活位点 S50 磷酸化迅速降低。对 5 名供体的单独分析显示，磷酸化动力学的变异适中，注释的 AKT 位点相关性更高，其中 AKT1S1 的 T246 位点供体间变异性最小。

（四）胰岛素靶点的供体变异性

计算所有单磷酸化肽段的 Pearson 相关系数，研究人员发现了一些供体变异性低（平均 r>0.9）的磷酸化位点，如 AKT1S1 - T246、GAB2 - S210 和 NACA - S1112；也有供体变异性高（r<-0.218）的位点，如 EVA1B - T158、TLE4 - S292 和 ADD3 - S677。除已知的胰岛素靶点外，还鉴定出一些在转录调节、mRNA 加工和蛋白质运输等生物学过程中具有极低供体变异性的胰岛素靶点 。将经典和非经典胰岛素靶点的磷酸化与细胞应激反应和 2 型糖尿病相关的磷酸化位点进行比较，发现 2 型糖尿病供体来源的人诱导多能干细胞衍生的成肌细胞（iMyos）中，一些非经典靶点的胰岛素刺激磷酸化发生改变。通过与全基因组关联研究（GWAS）数据对比，发现 43 种响应胰岛素差异磷酸化且由 2 型糖尿病候选基因编码的蛋白质，大多为非经典靶点。

（五）丝氨酸 / 苏氨酸激酶的时间分辨调节

胰岛素刺激后，研究人员发现 49 种蛋白激酶发生差异磷酸化，涉及细胞骨架动力学、囊泡运输、代谢、凋亡、有丝分裂和转录控制等多种细胞内信号通路 。通过 KSORA 分析，揭示了激酶激活的独特时间模式，不同时间点有不同的丝氨酸 / 苏氨酸激酶被激活。早期时间点（t? - t?.?），参与细胞周期和分化调节的激酶富集；中期时间点（t? - t??），胰岛素信号通路的知名激酶以及调节细胞骨架、细胞周期和代谢的激酶富集；晚期时间点（t?? - t??），p70 和 p90 核糖体 S6 激酶、细胞外信号调节激酶等参与代谢、转录控制和骨骼肌稳态的激酶富集。不同时间点胰岛素刺激下，AKT 作为主要激酶，其调节的底物数量不同，在 t??时最多可达 27 个注释底物。将富集的激酶映射到系统发生激酶组树，发现胰岛素刺激导致骨骼肌细胞中激酶的组特异性激活，AGC 家族成员最为显著。

（六）网络传播和子网识别

运用网络传播算法 “NetCore”，研究人员利用 1552 个显著调节的磷酸化肽段初始化 PPI 网络，构建了一个包含 220 个节点和 582 个连接的综合 PPI 网络 。该网络反映了胰岛素刺激下具有相似磷酸化时间动态的蛋白质间的相互作用，识别出一个包含 14 种丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶、57 个一级邻居、4 种蛋白磷酸酶和 47 个一级邻居的信号模块。模块中的激酶和磷酸酶通过一组共享的一级邻居连接，包括衔接蛋白、转录和剪接调节因子以及肌动蛋白细胞骨架相关蛋白。此外，还提取了一个节点间供体变异性低（Pearson's r>0.78）且边间（Pearson's r>0.73）反映网络相互作用和磷酸化动力学相似性的子网，该子网中显著富集了 mTOR 信号通路的蛋白质以及参与 mRNA 加工和剪接的 RNA 结合蛋白。

（七）生物途径的时间调节

对早期、中期和晚期显著调节的磷酸化肽段进行 Reactome 通路富集分析，发现不同时间点显著富集的通路存在差异 。早期时间点，细胞周期控制相关通路富集；中期和晚期时间点，酪氨酸激酶信号通路富集；晚期时间点，囊泡介导的运输通路富集。在大多数通路中，胰岛素刺激导致蛋白质磷酸化水平与基础状态相比有增有减。进一步分析通路激活的动态变化发现，“mTOR 信号” 通路中磷酸化肽段数量随时间增加，而 “肌肉收缩” 通路中磷酸化肽段数量减少。不同通路的供体间变异性也有所不同，mTOR 和 AKT 信号相关通路的供体变异性较低，而 TGF - β 信号和非受体酪氨酸激酶信号通路的供体变异性较高。

（八）相对磷酸化位点占用的时间动态

研究人员跟踪了 2741 个在至少一个时间点相对于基线有显著调节的磷酸化肽段的磷酸化情况，分析了胰岛素刺激过程中相对磷酸化位点占用的时间动态 。胰岛素刺激导致复杂的磷酸化和去磷酸化模式，早期磷酸化动态变化最大。1 分钟时显著调节的 976 个磷酸化肽段中，只有约 13% 在 60 分钟时仍持续差异磷酸化，这些位点多与细胞骨架和细胞内信号转导相关；60 分钟时显著调节的 1133 个磷酸化肽段中，53% 来自 60 分钟时发生的磷酸化 / 去磷酸化事件，且这些晚期磷酸化位点靶向大量 RNA 结合蛋白。磷酸化位点基序分析显示，持续磷酸化的肽段中 AKT 靶标的碱性共识基序更常见，而响应胰岛素去磷酸化的肽段中脯氨酸导向的共识序列更丰富。

（九）胰岛素刺激的剪接相关蛋白的磷酸化

大量胰岛素调节的磷酸化肽段来自参与 mRNA 加工不同阶段的蛋白质，研究人员进一步研究了人原代肌管中剪接体蛋白的时间依赖性磷酸化 。发现许多剪接体蛋白在胰岛素刺激下发生差异磷酸化，其磷酸化位点的时间模式存在显著差异。通过 RNA 测序分析，发现胰岛素刺激与 153 个转录本的可变剪接相关，主要包括外显子跳跃、可变 3' 剪接等事件，部分 mRNA 的剪接受胰岛素调节后可能导致无义介导的 mRNA 降解。

四、研究结论与讨论

本研究通过时间分辨的磷酸化蛋白质组学分析，全面揭示了人原代骨骼肌细胞中胰岛素调节的磷酸化蛋白质组的动态变化和供体间差异，为胰岛素信号传导机制提供了新的见解 。研究表明，胰岛素信号通路中的磷酸化事件具有强烈的时间动态性，且在蛋白质丰度无相应变化的情况下发生。不同激酶和底物在胰岛素刺激的不同时间点呈现特异性磷酸化模式，反映了激酶激活的阶段性和蛋白质磷酸酶的持续作用。

利用 “NetCore” 算法构建的 PPI 网络和子网分析，识别出了关键的信号模块和与 RNA 加工相关的蛋白质，强调了胰岛素在转录调控多个层面的作用 。分析供体变异性发现，经典胰岛素信号通路相关的磷酸化位点供体变异性低，而一些低变异性的 RNA 结合蛋白可能是胰岛素调节 RNA 加工和剪接的潜在靶点。

此外，研究还发现胰岛素刺激可导致生物途径的时间依赖性调节，不同途径的激活模式复杂，部分途径如 mTOR 信号通路呈阶段性激活 。胰岛素对剪接体蛋白的磷酸化调节与 mRNA 可变剪接相关，这为胰岛素调节基因表达的机制提供了新的证据。

然而，本研究也存在一些局限性，如磷酸化蛋白质组和全局蛋白质组的部分重叠、样本量有限、底物与激酶和磷酸酶的分配不精确以及对胰岛素调节的磷酸化位点和剪接事件的功能相关性了解不足等 。尽管如此，该研究仍具有重要意义，其揭示的胰岛素信号传导的时间依赖性阶段性磷酸化模式，为深入理解胰岛素作用机制和 2 型糖尿病发病机理提供了关键信息，也为未来精准医学研究和开发针对胰岛素抵抗和 2 型糖尿病的治疗策略提供了有价值的资源。