CRISPR-Cas9基因编辑效率优化：缩短gRNA支架poly-T序列的突破性进展

本研究聚焦于提升CRISPR-Cas9基因编辑效率，通过缩短gRNA支架中的poly-T序列，显著提高了基因编辑效果，为基因治疗提供了新的优化策略

　　基因编辑技术CRISPR-Cas9自问世以来，以其高效性和精准性在生物医学领域备受关注。然而，如何进一步提升其编辑效率一直是研究热点。近期，澳大利亚阿德莱德大学和南澳大利亚健康与医学研究所（SAHMRI）的研究人员在《BMC Genomics》上发表了一项突破性研究，揭示了通过缩短gRNA支架中的poly-T序列，能够显著提升CRISPR-Cas9基因编辑效率。这一发现不仅为基因编辑技术的优化提供了新的思路，也为遗传病的精准治疗带来了新的希望。

基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种强大的基因组修饰工具，广泛应用于基础研究和遗传病治疗。然而，传统的gRNA支架中存在一段4T序列，会抑制Pol III启动子（如U6启动子）的转录效率，从而限制了gRNA的表达水平和编辑效率。尽管在标准质粒转染条件下，大多数gRNA仍能实现接近完美的编辑效果，但对于一些T含量较高的gRNA，其转录水平较低，导致编辑效率不佳。为解决这一问题，研究人员提出了一种新的策略：将4T序列缩短为3TC序列，以增强gRNA的转录水平，从而提高编辑效率。

研究人员首先在多种细胞系中测试了55种不同的SpCas9 gRNA，发现大多数gRNA在标准转染条件下表现出接近完美的编辑效率。然而，部分T含量较高的gRNA表现出较低的编辑效率。通过qPCR检测这些低效gRNA的转录水平，发现其gRNA转录水平较低。为了提高这些gRNA的转录水平，研究人员采用了两种方法：一是增加U6启动子的数量，二是将4T序列缩短为3TC序列。结果表明，3TC序列的修改显著提高了gRNA的转录水平，进而提升了编辑效率。

在低质粒剂量条件下，研究人员发现3TC序列的gRNA支架表现出更高的编辑效率，这表明在有限的质粒供应下，增强gRNA转录水平对于提高编辑效率至关重要。此外，研究人员还发现，3TC序列的修改不仅适用于SpCas9，还与高保真SpCas9变体（如SpCas9-HF1和eSpCas9(1.1)）和碱基编辑器ABEmax兼容，并显著提高了其编辑效率。对于另一种常用的Cas9变体SaCas9，3TC序列的修改同样提高了其gRNA转录水平和编辑效率。

在实验技术方面，研究人员采用了质粒转染、qPCR检测、深度测序等关键技术方法。通过这些方法，研究人员系统地评估了不同gRNA支架对编辑效率的影响，并验证了3TC序列修改的优化效果。

研究结果表明，缩短gRNA支架中的poly-T序列是一种简单而有效的策略，能够显著提高CRISPR-Cas9基因编辑效率。这一优化策略不仅适用于SpCas9和SaCas9，还与高保真变体和碱基编辑器兼容。在低质粒剂量条件下，3TC序列的修改表现出更高的编辑效率，这对于基因治疗中有限的载体供应具有重要意义。此外，研究人员还将3TC序列的修改应用于EDIT-101治疗策略，显著提高了其性能。

讨论部分强调了缩短gRNA支架中poly-T序列的重要性。尽管在标准条件下，4T序列的gRNA支架已能实现较高的编辑效率，但在某些情况下，如gRNA序列本身T含量较高或质粒供应有限时，3TC序列的修改能够显著提升编辑效率。此外，研究人员还建议将这种优化策略应用于其他Cas9变体和碱基编辑器，以进一步提高基因编辑效率。未来的研究可以探索这种支架修改在不同表观遗传状态下的编辑效果，以进一步拓展其应用范围。