肠道芯片：预测黑色素瘤免疫治疗反应的新利器

　　

近日，来自意大利欧洲肿瘤研究所（Istituto Europeo di Oncologia – IRCCS，IEO）等多个机构的研究人员在《Nature Biomedical Engineering》杂志上发表了一篇题为 “A gut-on-a-chip incorporating human faecal samples and peristalsis predicts responses to immune checkpoint inhibitors for melanoma” 的论文。该研究意义重大，为理解肠道微生物群与宿主之间的相互作用提供了新的视角，并且有望通过肠道芯片模型预测黑色素瘤患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）的反应，为个性化治疗方案的制定奠定了基础。

一、研究背景

免疫检查点抑制剂（ICIs）在癌症治疗中取得了显著成效，尤其是在黑色素瘤的治疗方面，然而患者对 ICIs 的反应存在很大差异，并且对于最佳的药物组合和毒性问题仍有待解决。除了肿瘤自身的因素外，肠道微生物群已成为影响免疫治疗效果的关键外部因素。肠道微生物群包含多种微生物的基因和代谢功能，与肠道黏膜相互作用，维持肠道内环境稳定。但肠道稳态的破坏会影响抗肿瘤免疫和治疗反应，目前由于在免疫治疗期间无法进行肠道活检，限制了对微生物群 - 宿主相互作用分子机制的研究。

传统的小鼠模型虽然广泛用于临床前研究，但由于其与人类在解剖学、功能、免疫学和微生物方面存在较大差异，以及成本高、实验时间长和伦理问题等，其在转化研究中的价值有限。三维（3D）培养的原代人类肠道类器官相比传统二维（2D）细胞培养具有更高的细胞异质性和结构复杂性，但难以模拟蠕动运动、接触微生物或药物。微流控技术的出现克服了这些局限性，为研究微生物群 - 宿主相互作用提供了新的平台。

二、研究材料和方法

（一）细胞系和细菌菌株

研究使用了多种细胞系，包括从美国典型培养物保藏中心获得的 Caco - 2 细胞、由 G. Monteleone 赠送的 HT - 29 MTX 细胞、来自美国疾病控制与预防中心的 HMEC - 1 细胞以及从 The Jackson Laboratory 获取的 hiPSCs。同时，对这些细胞的培养条件进行了详细的设定。

（二）人类粪便和血液样本

粪便样本来源于健康供体以及对免疫治疗有反应和无反应的黑色素瘤患者，血液样本来自健康志愿者。所有样本的采集均遵循相关伦理准则，获得了参与者的知情同意，并经过 IEO 伦理委员会批准。

（三）肠道芯片制备

利用标准软光刻技术在米兰理工大学制备微流控芯片，该芯片由肠道上皮通道、微血管内皮通道和 ECM 层组成，通过特定的操作流程进行细胞接种和培养，包括将不同细胞系按比例接种到相应通道，并在特定条件下进行机械刺激培养。

（四）实验检测方法

研究运用了多种检测方法，如通过肠道上皮屏障通透性测定评估肠道屏障功能；利用免疫荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察细胞标记物的表达；进行黏液层染色以表征黏液层；开展 T 细胞黏附实验检测 T 细胞与微血管内皮细胞的黏附情况；提取总 RNA 并进行测序及后续数据分析；使用 qPCR 检测基因表达；通过基于微球的多重 ELISA 检测细胞因子水平；对粪便样本进行鸟枪法测序和分析等。

（五）关键技术路线

该研究构建了一种包含人类粪便样本和模拟蠕动功能的肠道芯片模型。首先，开发肠道芯片，将肠道细胞与微血管内皮细胞在微流控 3D 系统中共培养，并施加模拟蠕动运动。然后，将黑色素瘤患者的粪便样本加入肠道芯片的肠道通道，进行多组学分析，探究微生物群对肠道上皮细胞的影响。同时，对比有反应和无反应患者粪便样本对肠道芯片的不同作用，分析相关机制。最后，评估有反应患者粪便样本及其成分对改善肠道屏障功能的治疗潜力。

三、研究结果

（一）肠道芯片的开发

利用专有驱动技术开发出一种集成多种功能的肠道芯片模型，该模型由肠道通道和血管腔室组成，中间由类似 ECM 的凝胶层分隔。在肠道通道中接种 hiPSC 来源的类器官或 Caco - 2 与 HT - 29 MTX 的共培养细胞，血管腔室由 HMEC - 1 细胞形成。通过实验证实，该模型能够形成具有增殖、极化和分泌功能的肠道屏障，且包含多种生理相关的肠道细胞类型。

（二）机械驱动塑造肠道上皮

研究发现，模拟蠕动运动（变形 10 - 15%；频率 0.2Hz；培养 9 天，驱动 7 天）可促进 hiPSC 来源的肠道芯片上细胞的增殖、极化和黏液分泌，增强 3D 超细胞绒毛样结构的形成。同样的结果在 Caco - 2 和 HT - 29 MTX 共培养的肠道上皮小管模型中也得到了验证。此外，与 HMEC - 1 细胞共培养可加速肠道上皮细胞成熟为功能性和选择性屏障。

（三）肠道芯片中的转录变化模拟上皮反应

通过主成分分析（PCA）发现，暴露于黑色素瘤患者粪便样本的肠道芯片的转录谱受到微生物群的显著影响，基因集富集分析（GSEA）表明，处理后的上皮细胞发生了主要的重编程，涉及对病原体反应、肿瘤坏死因子（TNF）、核因子 κB（NF - κB）等信号通路的激活以及细胞周期和线粒体代谢相关基因的下调。与小鼠实验数据对比，发现该肠道芯片模型能够模拟体内宿主 - 微生物群的相互作用。

（四）肠道芯片揭示无反应患者的促炎特征

对接受免疫治疗的黑色素瘤患者的粪便样本处理后的肠道芯片进行转录组分析，PCA 显示无反应患者的粪便处理后的芯片具有独特的转录谱，与对照组差异显著。无反应患者的粪便样本导致肠道上皮细胞的细胞周期、DNA 复制和修复、线粒体生物发生和运输等多个过程受到抑制，同时激活白细胞介素和死亡受体信号传导等促炎途径，表明其对肠道上皮具有显著的促炎作用。

（五）肠道芯片对微生物群的反应与免疫治疗数据匹配

通过定量共聚焦显微镜观察发现，无反应患者的粪便样本处理后，肠道芯片的肠道屏障完整性受损，表现为 ZO - 1 和 β - 连环蛋白表达降低，同时微血管屏障完整性也受到影响，ICAM - 1 表达增加，微血管内皮细胞激活。而有反应患者的粪便样本对肠道屏障影响较小，类似健康供体。研究还发现，无反应患者粪便样本的促炎作用至少部分归因于脂多糖（LPS）依赖的信号激活，因为无反应患者粪便中 LPS 相关细菌基因富集，且 LPS 处理肠道芯片产生的效果与无反应患者粪便处理类似。

（六）无反应患者微生物群的可溶性因子模拟 LPS 的炎症效应

研究表明，无反应患者粪便上清液中的可溶性因子足以诱导肠道上皮细胞中 ZO - 1 减少和微内皮细胞中 ICAM - 1 增加，而有反应患者的粪便上清液对屏障完整性影响较小。此外，无反应患者粪便上清液处理后，肠道芯片中释放的炎症分子水平更高，进一步证实了其促炎作用。

（七）在芯片上测试微生物群因子的治疗潜力

研究发现，将有反应患者的粪便样本或上清液与无反应患者的粪便样本共同处理肠道芯片，能够改善肠道屏障完整性，减少炎症因子的释放。纯化的鞭毛蛋白也具有类似的效果，但不能挽救 LPS 诱导的肠道屏障破坏。这表明有反应患者微生物群衍生的产品对肠道屏障的炎症状态具有有益作用。

四、研究结论与讨论

研究人员开发的基于微流控的肠道芯片模型克服了当前 2D、3D 和体内系统的一些局限性，为研究微生物群 - 宿主相互作用提供了可靠的平台。通过该模型，发现黑色素瘤患者对免疫治疗的反应可基于患者粪便样本在肠道芯片上的作用进行预测。无反应患者的肠道微生物群具有促炎特征，可能通过 LPS 依赖的信号通路影响肠道上皮细胞，进而影响免疫治疗效果；而有反应患者的微生物群则具有改善肠道屏障功能的潜力。

尽管该模型存在一定的局限性，如不能完全重现人类肠道的生理学，但通过多组学方法，在一定程度上揭示了肠道上皮细胞对粪便微生物群反应的分子机制，为后续研究提供了方向。该研究为开发基于肠道微生物群的靶向治疗策略提供了理论依据，有望通过调节肠道微生物群提高免疫治疗的疗效，同时减少不良反应的发生，在癌症治疗领域具有重要的临床应用前景。