转录适应性上调杜氏肌营养不良症中utrophin表达的机制研究及其治疗应用

本研究针对杜氏肌营养不良症(DMD)患者中utrophin(UTRN)代偿性上调的分子机制，通过建立可诱导的DMD突变mRNA降解系统，首次揭示转录适应性(TA)在UTRN上调中的关键作用。研究人员利用CRISPR-Cas9构建含提前终止密码子(PTC)的DMD突变体，结合剪接转换反义寡核苷酸(ASO)和自切割核酶技术，证实DMD突变mRNA降解而非蛋白质缺失触发UTRN转录上调。该发现为DMD治疗提供了通过诱导遗传补偿的新策略，发表于《Nature》。

　　

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种致命的X连锁隐性神经肌肉疾病，由编码肌营养不良蛋白(dystrophin)的DMD基因突变引起。这种蛋白质作为细胞骨架与细胞外基质的机械连接，保护肌纤维免受收缩损伤。虽然已有外显子跳跃疗法、终止密码子通读化合物等FDA批准的治疗方法，但患者中其遗传旁系同源物utrophin(UTRN)的代偿性上调现象长期未获合理解释。这种代偿机制为何仅在特定突变类型患者中出现？其分子触发因素究竟是蛋白质缺失还是mRNA代谢异常？这些问题成为领域内亟待解决的科学谜题。

来自马克斯·普朗克心肺研究所(Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Germany)的Lara Falcucci等研究人员在《Nature》发表突破性研究，通过多学科方法揭示了转录适应性(Transcriptional Adaptation, TA)在UTRN上调中的核心作用。研究团队首先开发了可诱导的DMD突变mRNA降解系统，随后运用剪接转换反义寡核苷酸(ASO)和自切割核酶技术，证实DMD突变mRNA降解而非蛋白质缺失是UTRN上调的关键触发因素。这一发现不仅阐明了DMD患者临床表现异质性的分子基础，更开辟了通过诱导TA实现遗传补偿的全新治疗途径。

关键技术方法包括：1)利用CRISPR-Cas9构建含PTC的DMD E37突变HEK293T细胞系；2)通过拓扑异构酶抑制剂(CPT)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)调控转录延伸速率；3)设计靶向DMD外显子的剪接转换ASO；4)在DMD迷你基因中插入自切割锤头核酶(HHR)；5)采用患者来源的肌管细胞进行功能验证；6)RNA-seq分析转录组变化。

增强DMDE37包含的研究显示，促进含PTC的可变剪接外显子包含会触发DMD突变mRNA降解和UTRN上调。研究人员发现TSA处理可通过改变染色质结构促进E37包含，而CPT则抑制其包含。在DMDPTC/+细胞中，诱导E37包含导致DMD mRNA水平显著降低，同时UTRN mRNA和蛋白水平上调1.5-2倍，与mdx小鼠模型观察到的幅度相似。重要的是，这种上调伴随UTRN前体mRNA增加，表明是转录水平调控。

阻断NMD可逆转UTRN上调的实验证实了mRNA降解的关键作用。当敲低NMD核心因子UPF1和SMG6时，DMDPTC/+细胞中DMD突变mRNA积累，同时UTRN上调消失。相反，在WT细胞中阻断NMD虽降低DMD mRNA水平，但不影响UTRN表达。这些结果明确将UTRN上调与NMD途径联系起来，而非简单的蛋白质反馈机制。

DMDPTC迷你基因触发UTRN上调的发现进一步支持TA机制。在WT细胞中过表达含PTC的DMD迷你基因(E338X、E1421X和Q1624X)可重现UTRN上调，而野生型迷你基因无此效应。更引人注目的是，在DMDWT迷你基因内含子中插入自切割核酶(T3H38-HHR)也能诱导UTRN上调，证明无需改变蛋白质编码序列，仅通过RNA降解即可触发补偿机制。

在治疗应用方面，研究团队使用剪接转换ASO诱导DMD外显子跳跃。靶向E6或E52的ASO在WT肌管中几乎完全跳过这些外显子，导致DMD mRNA降解和UTRN上调。值得注意的是，部分外显子跳过(25-50%)即可引起UTRN上调，而无需显著降低DMD mRNA或蛋白水平，这为治疗剂量优化提供了重要依据。在DMD^ΔE52患者来源肌管中，使用类似eteplirsen的ASO(i51-5ss)恢复阅读框后，UTRN上调减少33.85%，提示现有疗法可能无意中削弱了有益的代偿反应。

这项研究首次在人类细胞中证实TA现象，揭示了DMD患者临床表现异质性的分子基础。携带无义或移码突变的患者因TA机制获得UTRN代偿性上调，而框内缺失患者则无此保护效应。这解释了为何后者往往表现出更严重的表型。从治疗角度看，研究提出了"增强代偿"的新策略——通过ASO或核酶技术协同激活TA途径，可能使各类DMD患者受益。特别是自切割核酶迷你基因的设计，为基因治疗提供了不依赖突变类型的普适性工具。这些发现不仅对DMD治疗具有直接指导意义，更为其他遗传疾病的治疗策略开发提供了范式转换。