Kupffer细胞代谢应激肝细胞的A1AT失调驱动MASH和纤维化

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎新机制：A1AT/PR3/IL-32γ 轴的关键作用

来自忠北国立大学（Chungbuk National University）药学院和医学研究中心的 Jeong-Su Park 等人在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “A1AT dysregulation of metabolically stressed hepatocytes by Kupffer cells drives MASH and fibrosis” 的论文。这一研究在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）领域意义重大，为理解 MASH 的发病机制和开发新的治疗策略提供了关键线索。

研究背景：探寻 MASH 发病机制的关键谜题

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）正逐渐成为全球范围内肝衰竭的主要诱因。它的发病率不断攀升，病情进展可能引发严重后果，已然成为全球健康的重点关注问题。在 MASLD 发展为 MASH 以及肝纤维化的过程中，库普弗细胞（KCs）调控的肝细胞损伤、肝内炎症，以及肝星状细胞（HSCs）合成的细胞外基质蛋白过度积累起着关键作用。然而，尽管科研人员进行了大量研究，MASLD 进展为 MASH 和肝纤维化的复杂分子机制以及肝内细胞间的相互作用仍未完全明晰。

在本研究中，α-1 抗胰蛋白酶（A1AT）成为关键研究对象。A1AT 是一种主要由肝细胞产生的急性期糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。A1AT 缺乏症作为一种遗传性疾病，会因突变型 A1AT 的积累和中性粒细胞弹性蛋白酶的失调，导致肝脏和肺部损伤。但在 MASH 这种非遗传性背景下，A1AT 缺乏的影响却鲜为人知。

在 MASH 患者体内，免疫细胞会大量涌入肝脏，单核细胞来源的库普弗细胞（MoKCs）数量显著增加，它们取代了胚胎来源的库普弗细胞（EmKCs），进而放大了炎症反应。MoKCs 分泌的蛋白质，尤其是蛋白酶 3（PR3），在免疫反应中扮演重要角色，参与促炎细胞因子和受体的蛋白水解过程，以及微生物的清除。以往研究表明，中性粒细胞是 PR3 分泌的主要来源，而单核细胞来源的 PR3 也与囊性纤维化、小血管炎等疾病的恶化相关。不过，在 MASH 中，这些失调的蛋白水解酶如何影响疾病进展，以及调节细胞因子加工的具体机制，还基本处于未知状态。

白细胞介素 - 32（IL-32）作为多种炎症性疾病的关键调节因子，已被发现有 9 种亚型，其中 IL-32γ 被认为活性最强，在免疫调节中发挥重要作用。近期研究显示，IL-32 与非酒精性脂肪性肝病活动评分（NAS）、胰岛素抵抗和转氨酶水平存在关联，暗示其与 MASLD 关系密切。但 IL-32γ 在 MASLD/MASH 发病机制中的详细作用机制仍有待揭示。

研究方法：多技术融合解锁疾病奥秘

1. 人鼠血清分析：研究人员获取了来自多家医院的 56 例 MASLD 患者的血清样本，以及健康对照者的血清样本。通过酶联免疫吸附测定（ELISA），检测血清中 A1AT、中性粒细胞弹性蛋白酶、PR3 等蛋白的水平。对于小鼠，通过心脏穿刺采集血液，分离血清后检测丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、胆固醇等指标，同时使用相应的 ELISA 试剂盒检测小鼠血清中的 A1AT、中性粒细胞弹性蛋白酶和 PR3 水平。

2. 小鼠模型构建：选用野生型（WT）小鼠和 A1AT 基因敲除（KO）小鼠，同时构建了过表达人 IL-32γ 的转基因（Tg）小鼠，并通过杂交获得 hIL-32γ/A1AT KO 小鼠。将这些小鼠分为不同组，分别喂食快餐饮食（FFD）或正常饮食（NCD）24 周。在喂养的最后 6 周，部分小鼠接受人血清来源的 A1AT（Respreeza）或 PR3 抑制剂西维来司他（sivelestat）处理。所有动物实验均遵循忠北国立大学机构动物护理和使用委员会的指导方针进行。

3. 组织学分析：采集小鼠肝脏组织，用福尔马林固定后石蜡包埋。对石蜡切片进行苏木精 - 伊红（H&E）染色、免疫组织化学（IHC）染色和天狼星红染色，分别用于观察肝脏结构、免疫细胞浸润和胶原沉积情况。此外，还进行了 BODIPY 染色，以观察肝脏组织中的脂质分布，并利用显微镜和相关软件对脂质和纤维化区域进行定量分析。

4. 分泌组蛋白质组学分析：分离 NCD 和 FFD 喂养小鼠的原代肝细胞，在无血清培养基中培养 24 小时后收集条件培养基（CM）。通过超滤浓缩蛋白质，经过一系列处理后进行纳米液相色谱 - 电喷雾电离串联质谱（MS/MS）分析，以筛选未被识别的肝细胞因子。

5. 蛋白质纯化：将 PR3 切割的 IL-32γ 的 N 端和 C 端结构域的质粒，通过酶切位点转移到表达载体中，利用大肠杆菌进行表达和纯化。

6. 转录组分析：分析公开的人类基因表达综合数据库（GEO）中的 RNA 测序（RNA-seq）数据，以及从 Broad Institute 的单细胞门户网站获取的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据。同时，将本研究中的 R 刺激的肝细胞的 RNA-seq 数据存入 GEO 数据库。

7. 统计分析：运用 GraphPad Prism 7 软件进行非配对 Student's t 检验，以 P<0.05 为具有统计学意义，所有数据均以平均值 ± 标准误表示。

研究结果：层层揭开疾病机制的神秘面纱

1. A1AT 在 MASLD 患者和小鼠中表达下调：研究人员通过培养 KCs 与不同饮食小鼠的肝细胞条件培养基（HCM），发现 FFD 喂养小鼠的 HCM 能激活 KCs，促进其炎症基因表达上调。对 HCM 进行分泌组分析后发现，FFD 组与 NCD 组相比，有 62 种分泌蛋白存在显著差异，其中 A1AT-5 是下调最明显的蛋白。在人和小鼠中，进一步研究发现 A1AT 的表达与 MASLD/MASH 的疾病进展相关，FFD 喂养小鼠和 MASLD/MASH 患者的 A1AT 表达均降低，同时 PR3 水平升高，PR3/A1AT 比值增大，且这些变化与 ALT 和胆固醇水平相关。

2. A1AT 缺失加剧小鼠肝脏炎症和纤维化：利用 A1AT KO 小鼠模型研究发现，A1AT 缺失导致小鼠血清和肝脏组织中 PR3 水平显著升高，虽然 NCD 喂养的 A1AT KO 小鼠体重下降，但 FFD 喂养后，其肝脏重量和肝体比与 WT 小鼠无差异。不过，A1AT KO 小鼠的 ALT、AST 和胆固醇水平更高，肝脏免疫细胞浸润增加，CLEC4F 阳性 KCs 数量增多，肝脏炎症和纤维化相关基因表达上调，胶原沉积也显著增加。

3. 调节 A1AT/PR3 轴可有效阻断小鼠 MASH 进展：给小鼠使用 Respreeza 和 sivelestat 进行治疗，结果显示这两种药物虽对小鼠体重影响不明显，但能有效减轻 FFD 诱导的肝脏重量、肝体比以及 ALT 和胆固醇水平的增加。同时，治疗组小鼠肝脏的炎症细胞浸润减少，肝细胞气球样变性和脂质积累减轻，肝脏炎症和纤维化相关基因表达下调，这表明调节 A1AT/PR3 轴具有治疗 MASH 和肝纤维化的潜力。

4. IL-1β 通过 HNF4α 抑制肝细胞中 A1AT 的表达：研究人员发现，用棕榈酸和 H?O?刺激肝细胞，并不会导致 A1AT mRNA 表达下调。而 KCs 分泌的炎症细胞因子，尤其是 IL-1β，能显著降低 A1AT mRNA 表达。通过 RNA-seq 分析和一系列实验，研究人员确定 IL-1β 通过抑制转录因子 HNF4α，进而抑制 A1AT 的转录，这一机制在人、小鼠和非人灵长类动物中均保守。

5. MoKCs 是 MASH 中 PR3 水平升高和肝脏炎症的关键因素：研究发现，FFD 喂养小鼠和 MASH 患者肝脏中 PR3 阳性巨噬细胞浸润增加，scRNA-seq 分析显示 FFD 喂养小鼠的 KCs 和胆管细胞中 Prtn3 表达上调，且 FFD 喂养小鼠的 MoKCs 数量增加。进一步研究表明，MoKCs 比 EmKCs 表达更高水平的促炎基因和 PR3，A1AT 缺失会增加 MoKCs 的比例和活性，而 sivelestat 可抑制这一作用，同时 PR3 具有自分泌激活 MoKCs 的作用。

6. PR3 结合靶点 IL-32γ 具有抗炎作用：通过共免疫沉淀和细胞因子阵列分析，研究人员发现 IL-32 是 PR3 的结合靶点之一，且在正常人类肝脏中表达较高。单因素逻辑回归分析显示，IL-32 与 SERPINA1 联合能协同预测 MASH 高风险患者。在体外实验中，IL-32γ 能显著降低 KCs 中促炎细胞因子的表达，发挥抗炎作用。

7. IL-32γ 减轻肝脏脂肪变性、炎症和纤维化：hIL-32γ Tg 小鼠在 FFD 喂养下，体重、肝脏重量和肝体比低于 FFD 喂养的 WT 小鼠，血清 ALT 和胆固醇水平也显著降低。组织学分析表明，IL-32γ 过表达能减轻肝脏脂肪积累、炎症和纤维化，这表明 IL-32γ 在 MASH 发病机制中具有保护作用。

8. A1AT 缺失抑制 IL-32γ 对 FFD 诱导的 MASH 和纤维化的保护作用：hIL-32γ Tg 与 A1AT KO 小鼠杂交产生的 Tg/KO 小鼠，在 FFD 喂养下，血清 PR3 水平升高，IL-32γ 的表达和血清水平降低，且 IL-32γ 的裂解增加。这些小鼠的肝脏脂肪变性、炎症和纤维化加重，血清 ALT 和胆固醇水平升高，这表明 A1AT 对维持 IL-32γ 的治疗效果至关重要。

9. PR3 切割的 IL-32γ 的 C 末端是炎症和纤维化的强效诱导剂：研究发现，PR3 能切割 IL-32γ，阻断 PR3 与 IL-32γ 的结合位点（V104A 突变）可抑制 IL-32γ 的降解，维持其抗炎功能。PR3 切割的 IL-32γ 的 C 末端能诱导 KCs 向 M1 型极化，激活 NFκB 和 MAPK 信号通路，促进促炎细胞因子的产生，同时不能抑制 HSCs 的激活，导致纤维化相关基因表达增加。

研究结论与讨论：开拓 MASH 治疗新方向

本研究揭示了炎症诱导的肝脏 A1AT 下调和 PR3 上调，导致 IL-32γ 蛋白水解在人类 MASH 中的临床意义。A1AT 缺失会增加肝脏 PR3 水平，主要由促炎 MoKCs 的募集和扩张驱动。PR3 表达上调及其对 MoKCs 的自分泌作用，会放大肝脏炎症，在 MASH 进展中起核心作用。通过分泌组蛋白质组学发现，A1AT 是 FFD 诱导的 MASH 模型中减少最显著的肝细胞因子，这与 MASH 患者血清 A1AT 水平降低一致。用 Respreeza 和 sivelestat 进行治疗干预，可显著减轻小鼠的肝脏脂肪变性、炎症和纤维化，表明增强 A1AT 表达和抑制 PR3 活性可能是治疗 MASLD 患者肝脏疾病进展的有前景的策略。

研究还发现，PR3 能介导 IL-32γ 的蛋白水解切割，促进 KCs 的 M1 极化，无法阻止 HSCs 的激活。IL-32γ 在体内具有保护作用，过表达 hIL-32γ 可改善脂质积累、肝脏炎症和脂肪性纤维化。这些结果强调了 A1AT/PR3 失衡通过对 IL-32γ 的蛋白水解调节，在调节肝脏脂肪变性、炎症和纤维化严重程度中的关键作用。

此外，研究挑战了传统观点，发现炎症细胞因子可通过转录因子 HNF4α 导致 A1AT 转录下调，这一机制独立于与 MASLD 中内质网应激相关的棕榈酸和 H?O?，为探索炎症细胞因子如何选择性改变肝细胞因子谱提供了新方向。

然而，本研究也存在一定局限性。比如，未明确 IL-32γ 对 FFD 诱导的体重增加和脂质积累的影响机制，且仅关注了分泌型 IL-32γ，对细胞内 IL-32γ 在肝细胞中的作用以及在 MASLD 进展中的细胞类型特异性作用尚未进行研究。未来需要进一步研究来明确这些机制，为 MASH 的治疗提供更全面的理论依据。

总体而言，该研究为 MASH 的发病机制提供了新的见解，发现了 A1AT/PR3/IL-32γ 轴在疾病进展中的关键作用，为开发针对 MASH 和肝纤维化的新治疗策略奠定了重要基础。